Рекомбинантная фаговая днк ра @ мз, кодирующая синтез слитого белка ангиогенин- @ -пептид @ -галактозидазы и способ ее конструирования

 

Изобретение относится к биотехнологии , в частности к генетической инженерии, и может быть использовано в работах по оптимизации экспрессии ангиогенина в E.coli. Целью изобретения является получение слитого белка ангиогенин «L -пептид-(J-галактозидаэц E.coli. Рекомбинантную ДНК рАпМЗ получают введением кодонов, кодирующих дипептид Asp-иго, на место терминирующих кодонов синтетического гена ангиогенина, проклонированного в фаге М13 тр.8. Замену кодонов осуществляют методом олигонуклеотид-направленного мутагенеза.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (51)5 С 12 ?1 15/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И (ЛНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

К А ВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ (46) 15. 01; 91 ° Бюл. 11- 2 (21) 4396964/13 (22) 24.03.08 (71) Новосибирский институт биоорганической химии СО AH СССР и Институт терапии СО А?Я СССР (72) С.П.Коваленко, В.В,Горн, В.Ф,Зарытова и Н.П.?1артвецов (53) 575.224.2;577.2/048(038,8) (56) Gene 1987, v. 56, Р 1, р.61-70. (54) РЕКОМБИИА11ТНАЯ чАГОВАЯ ДШ(-pAn, МЗ, КОДИРУ1ЩАЯ СИНТЕЗ СЛИТОГО БЕЛКА

АНГИОГЕНИН-g-ПЕПТИД Р-ГАЛАИТОЗИДАЗЫ

И СПОСОБ ЕЕ КОНСТРУИРОВАНИЯ (57) Изобретение относится к биотехИзобретение относится к биотехно- логии, в частности к генетической инженерии, и представляет собой рекомбинантную фаговую ДИК рАп ?13, содержащую полинуклеотиды, кодирующие последовательно аминокислотные остатки 1-123 ангиогенина человека и остатки 8-148 5 гапактозидазы Е.coli трансляционно слитые под контролем промотора р lac и сайта связывания рибосом, с возможностью продукции в трансформированных ею бактериях

Е.coli Л1103 гибридного белка, и способ ее конструирования.

Целью изобретения является получение слитого белка ангиогенин-Jпептид 9 --галактозидаэа.

Рекомбинантная фаговая ДНК рАп?8, кодирующая синтез слитого белка ангиогенин- о1,пептид P --галактозидазы

E.ñîli, состоит.из следующих элементов:

„,Я0„„1552645 A 1

2 иологии, в частности к генетической инженерии, и может быть использовано в работах по оптимизации экспрессии ангиогенина в Г.coli. Целью изобретения является получение слитого белка ангиогенин g-пептид-(3-галактозидаэы Е.coli. Рекомбинантную ДШ(рАп?13 получают введением кодонов, коднрующих дипептид Asp- Bо, па место терминирующих кодоиов синтетического гена ангио гении а, проклонированного в фаге М13 тр.8. Замену кодонов осуществляют методом олигонуклеотид-направленного мутагенеэа. фаговой ДНК вектора ШЗ мр8, раз.— мер которой 6,4 т,п .о,;

EcoRl - Pst I фрагмента, содержащего структурный ген ангиогенина человека; Ж фрагменты содержат следукщие гены: р

1 Х кодирующие структурные и регуляторные белки фага И)3; гены геи

1асЕ, кодирующий Ы -пептид P"галактозидаэы Е.coli; ген Ang, кодирунищий ангиогенин человека;

Сл молекулярная масСа рекомбинантной фаговой ДН(равна 10,6 мД (размер

6,8 т.п,о.), Рекомбинантную ДНК рАп ? 3 коистру ируют путем отжига одноцепочечной фаговой Д11К, содержащей ген ангиогенина с олигонуклеотидами следующих последоватапьностей:

5 ; СТТСССТССАССССАТСТССТССАССС—

3 (1) и

1552645

5 — ТСССАСТСАСОА "GT -; 3 (2(), вторую цепь пблученных гетеродуплексон ! дйстраивают большим фрагментом ДНК— полимераэы 1 Е.eoli.и обрабатынают

ДИК-лигаэой, образовавнимися двухце" почечными ДШ(трансфицируют клетки, H.co1i Л1103, клетки высевают на среду с индикат?Ором Р -галактозидазной активности, и после инкубации от 10 бирают образовавшиеся синие колонии, Отличные От исхОдных бепых((из синих колоний выращивают фаг,.„из:которого выделяют рекомбинаци?о Д?31(, Выбор структуры олигонуклеотида (1) . обусловлен, во-первых, необходимостью введения кислотолабнльного сайта Asp — Pro между частями слитого белка, соотнетству?ощими ангиогенину и Ы-пептиду jb-галактозидаэы Е,coli ( а, во-вторых, расчетами теипературы гибридиэацж? олигону?клеотида с одноцепочной фаговои Д1К. Исходя иэ того, что плечи олигонуклеотида (1) слева и справа от нносимь?х мутаций гибридизуются независимо, для обеспечения температуры гибридизации комплекса

+28 + 36 с необходимо sbD?o испольэовaT5 именно дапиуи (1 1 «тнуктуру, Олигонуклеотиды,, имеющие температуру гибрйдиэации 28 — 36 С, оптимальны для введения олигопукпеотид — направленных мутаций H одноце??Оч1 чнуЮ фа гоную ДИК. Темпеоатчн 1 гибридизa??HH . рассчитывали по эмпирической формуле .

Т С --- 4?-С+(- )+2 (.А+ 1."), где G,„А, Т,- Сколичество соотпетстну(О??Нх звеньев

Олигонуклеотидя. ПО приведенной формуле! 1 С = 4 ° i + ". ° 3 -- 34 С для ле-. ной части комплекса T > С = 4 ° 7 ?.

+ 2,4 = 36 "С для праной части комп"лекса. Олигонуклеотид (1) синтезировали с помощью янтомати -?ескОгО син теэатора олигонуклеотидон "Виктория —. 4?:1".

Олигону_#_JIQGTHQ (1) llpH ноздеHcTBHH им на. ДШ(hara, рАП,„ представляющего собой фаг 1113 мр8 с проклониронанным геном. ангиогенина, обеспечивает получение ДШ(рАН 113„ направляющей синтез

50 слитого белка ??Нг?1огенин-до-пептид

Р-Галактоэидаэы, которь?й легко тести" руется при Вь?делении и может быть расщеплен до ангиогенина и о?:-пептида мягким кислотным гидролиэом.

П р и и е р 1, Огигонуклеотиды со структурой 5 — (".77 GCTGCAGCGCATGT

GGTCGWCG(— 3 5 — ТСССАСТСАССА

""GT — 3 синтезируют на -.åðèéíoì оте" честнеином автоматическом синтезаторе олигонуклеотидов путем фосфатамидного метода, После завершения синтеза и удаления всех защитных групп, кро" ме 5 — концевой диметокситритильной, продукт выделяют методом обращенно? азовой ВАШИХ, удаляют диметокситритильную группу и рехроматографируют на колонке с обращенно-фазоным носителем. Олигонуклеотиды фосфорилируются с помощью Т4-полинуклеотидкинаэы.

Одноцепочечкую ДШ(фага рАп, содержащую структурный геН ангиогенина челонека, инкубируют с олигонуклеотидами (1) и (2) при 95 С в буфере, содержащем 10 ???11 тряс-НС1 рН S,0 10 mH

М@С1 в течение 2 мин, смесь медленно охлаждают до комнатной температуры, добавляют ЙИ TP до 0,5 ш11 каждого, инкубируют 30 мин при 25 С с большим фрагментом ДШ(-полимераэы I Е.соli, затем добавляют ДШ(-лигаэу hara Т4, инкубируют еще 4 ч при +14 С, после чего аликвоту реакционной смеси используют для трансфекции.

Компетентные клетки для трансфекции готовят следующим образом, Клетки Е,со1i JM103 иэ 50 мп среды 2 х YT (16 r триптона, 10 r дрояскеного экстракта, 5 г МаС1 на 1 л воды) при тит- l ре 5;10 кл/мл осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 25 мл сте-, рильного 50 mN СаС1 при О С, вновь осаждают 10 мин 5000 е при +4оС, ре" суспендируют н 3,6 мп 50 ???11 СаС1 при О С(, инкубпрувт 30 мин при О С.

К 200 мкл клеток добавляют 20 нг гетеродУглексной ДП:(, инкубируют ЗО мин при 0 С, затем прогренают 2 мнн при

42 С, добавляют 200 мкл экспоненциальной Л1103, 40 мкл 2% 7-pal H

10 мкл 0,1 И 11?ТС и с 3 мл верхнего ягара высенают на чашку с ??Нжним ага" ром. Чере" 12 ч Образонынаются синие и белые колонии, Среди 603 белых колоний было обнаружено 6 синих. Синие колонии стерильно изолируют микробиологической петлей; каждуЮ колонию помещают в пробирку, содержащую 5 мп

2 х УТ бульона, пробирки встряхивают

1 ч при 37 С. Фаги иэ пробирок рассеивают до отдельных колоний, отдельи?е колонии вновь изолируют и помеща?от н пробирки с 5 мл 2 х 7Т бульона, добявля?от 50 мкл культуры Г.coli

Л1103 в зкспоненциальиой фазе, роста.

После 5 ч встряхивания ??pH 37ОС клетки отделяют цеитрифугиронапием 5 мин

Формула изобретения

1. Рекомбинантная фаговая ДН1(рАа

М3, кодирующая синтез слитого белка ангиогенин-, -пентид P-ãàëàxòoçèäsçû, мол. мас. 10,6 и размером 6,8 т,п.о., содержащая: фаговую ДIП(вектора И13 мр8 раз" мером 6,4 т.п.о.;

EcoR1 - Pst 1-фрагмент, размером

0,4 т.п.о, со структурным геном Agn человека, кодируюп1им белок, состоящий иэ 1-123 аминокислотных остатков ай-, гиогенина человека и двух дополнительных С"концевых аминокислотных остатков Asp н Pro; ген lacZ, кодируюцим 4-пептид

Р-галактозидазы Eschericho coli, состоящий из 8-146 аминокислотных остатков Р -галактозидазы; гены 1-Х, кодируюцие структурные и регуляторные белки фага И13; сайты рестрикции;

EcoRl, t1co l, Pst I, Itind III, Ban HI, Bgl II.

2, Способ конструирования рекомбинантной фаговой ДНИ рАп ИЗ, кодирующий синтез слитого белка ангиогенин-о -пептид $-ãàëàêòos ùàçû, заключакнцийся в том, что одноцепочную ДШ( фага, кодирующего ген ангиогенина, отжигают с олигонуклеотидами следующих последовательностей:

5 15526

6000 g, к супернатанту добавляют Wa01 до конечной концентрапии 0 5 И и по1

l лиэтиленгликоль 6000 до 37.. После

15 мин инкубации при комнатной темпе-.

5 ратуре фаг собирают центрифугированием 10 мин l0000 g. Супернатант тщательно удаляют, осадок ресуспенциру ют в 100.мкл TE — буфера (10 mM трис

ПС1 рН 8,0 ЕДТА 1аИ), дважды экстра- 10 гируют фенолом, 1 раз. хлороформом, ДШ(осаждают этанолом, ресуспендируют в 15 мкл II 0 и по 2 мкл используют для анализа первичной структуры

ДШ(. Полученная ДН1(обозначена рАп МЗ. 15

Пример 2. Использование рекомбинантной ДИI(рАп ИЗ для получения слитого белка ангиогенин-,/-пептид

$-галактоэидазы Е.coli, Рекомбннантную фаговую Д?1К рАпИЗ трансфицируют 20 в клетки Jt1103 по методу, описанному в примере 1, и получают штамм,.продуцируюцнй слитый белок ангиогенин- пептнд -гапактозидаэы Е.coli. 11аличие слитaro белка тестируют по присутствию Р -галактозидаэной активности в клетках Г,со1i Л1103, несущих фаг рАпИЗ. Фаг размножается с той же интенсивностью, что и исходный фаг рАп, несуций ген ангногенина, однако 30 в отличие от рАп фаг рАпИЗ придает. клеткам Л1103 Р-галактозидаэную активность °

5 -галактоэидаэная активность в клетках Jt1l03 тестируется только при малнчии инфнцируюцего фага И13 мр8 или ШЗ pAn?13. Э случае фага ?1! 3 активность P-ãaëàêòoçèäàçû формируется

sa счет g-пепетида, а в случае И13 рАп?13 — за счет белка ангиогенин- - 4p пептид (-галактоэидазы и составляет

76,8 н 35,3 МЕ соответственно. В слу чае фага И13 рАп активность P" галактозидазы полностью отсутствует.

Изобретение позволяет получить ре" 45 комбннантную ДШ?, направляющую синтез слитого белка ангиогении-g-пептид

Р-галактоэидазы Е.coli, Белок легко тестировать по Р -галактозидаэной активности в присутствии экстракта кле- я0. ток Л1103, несущих дефектную 5-галактозндазу, способную активизироваться

o "ïåïòHäîì. Экспресс-тестирование, легко достигаемое по предлагаемой схеме, позволяет подобрать оптималь- gg ные элементы для экспрессии белка с последующей оптимизацией процесса культивирования микроорганизмов, несущих такую генно-инженерную конст45 6 рукцию. Значительно облегчается и очистка такого слитного белка, для этого достаточно фракционировать суммарные белки клеток, несущих рекомби-. наитную ДШ(с закодированным слитым белком и определять активность Р-га лактозидазы во фракциях, предварительно. добавляя экстракт Л1103 в аликвоты фракций. После вьщеления слитого белка из него получают ангиогении, для этого достаточно с помощью мяг (о«

ro кислотного гидролиза расщепить введенный дипептид Авр » Pro. Преимущеетвом способа конструирования рекомбинантных фагов, направляющих синтез слитых с oL-пептидом Р-галактозидазы белков, является также его универсальность. Он может быть применен для генов любых белков при условии клонирования этих генов в фагах серии

ИIЗ. Такой способ может быть незаменим в случае невозможности (или трудоемкости, дороговизны) тестирования активности какого-либо генно-инженер ного белка.

Составитель Т. Забойкина

Техред Л.Сердюкова .

Редактор Л.Лашкова

Корректор М.Поко

Заказ б7б Тираж 375 Подписное

ВНИИПИ ГосударстВенного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101

7 )552б45 в

5 — CTTGGCTGCAGCGGATCTGGTCGACGG-3 клетки высевают на среду с индикатоФ I

5 — ТСССАСТСАССАССТ - 3, вторую ром p -гапактоэидазной активности и ель полученных гетеродуплексои до- после инкубации отбирают образовавши „траивают большим фрагментом ДШ(еся колонами синего цвета, выращивают волимераэм I и обрабатынают ДИ1(-лнга" фаг, из которого выделяют рекомбинантзой, образовавшимися двуцепочечными надю ДНК рАп ИЗ.

ДН1(транс@екцируют клетки R.ñî11 ЛИ103,