Способ подготовки биологического материала для иммуноферментного анализа на спид

 

Изобретение относится к области медицины, в частности к области иммунологии , и может быть использовано при подготовке бис/материала для диагностики СПИДа. Цель - повышение специфической активности биоматериала. У больного из пальца берут кровь, помещают в отдельную лунку 96-луночного планшета для иммуноферментного анализа, высушивают при комнатной температуре . Способ позволяет повысить специфическую активность биоматериалэ и уменьшить количество ложнеположительных реакций .в 9 раз, а кроме того, сохранить активность а течение 5 сут. 8 Л

СОО3 СОЮЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИМЕСНИХ

РЕО 1УБЛИН

ИЕ (Н) (51)5 1 1)1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

М А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

00 ИЗОБРЕТЕНИЯМ И OTHPblYHRM

flPM УНТ СССР (46) 15.01.91.вю. В 2 (2 I ) 4336867/14 (22) 14.12.87 (72) Л.А. Кожемякин, В.В. Костюшюв, А.Г. Налых, Е.В ° Костюшов, А.А. Тяптин, А.П. Козлов, Ю.A. Севрук, И.Г. Бондаренко и В.Н. Ефимов (53) 615 ° 375(088.8) (56) Инструкция о порядке обследования доноров и населения на СПИД и проведения диспансерного наблюдения эа лицами, инфицированными вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) Ю 04"дсп/15 от 20.02.87. МЗ СССР). (54) СПОСОБ ПОДГОТОВКИ БИОЛОГИЧЕСКОГО .

МАТЕРИАЛА ДЛЯ ИИИУНОФЕРИЕНТНОГО АНАЛИ.

ЭА НА СПИД

Изобретение относится к области медицины, в частности к области иммунологии, и может быть использовано для диагностики СПИД.

Целью изобретения является hoBbl» шение специфической активности биоматериала .

Способ осуществляется следующим обра зом.

Забор бионатериала (крови) осуществляется иэ пальца, после чего пробу цельной капиллярной крови наносят на твердофаэный носитель и высушивают при комнатной температуре.

Пример I. У обследуемой

Т.Л- берут 3 мл крови иэ вены, центрифугируют при 3000 об/мин для получемия сыворотки, после чего сыворотку хранят при +4 C до момента исследования в ИФА с помощью тест-системы предприятия "Амтиген" (СССР) . На сле2 (57) Изобретение относится к области медицины, в частности к области иммунологии, и может быть использовано при подготовке биоматериала для диагностики СПИДа. Цель - повышение специфической активности биоматериала .

У больного иэ пальца берут кровь, помещают в отдельную лунку 96-луночно" го планшета для иммуноферментного анализа, высушивают при комнатной температуре. Способ позволяет повысить специфическую активность биоматериалв и уменьшить количество ложноположительных реакций.в 9 раэ, а кроме того, сохранить активность в течение

45 сут. дующие сутки 10 мкл сыворотки вНосят в лунку пленшета для иммунологических . » реакций, в два этапа растворяют в жидкости, находящейся в комплекте тест-системы до разведения 1:100 и исследуют на наличие антител к ВИЧ в соответствии с инструкцией к текст" системе. При спектрофотометрической оценке результатов ИФА величина экстимкции составляет 1,287, что свидетельствует о высокой. вероятности маличия у обследуемой СПИД (экстинкция отрицательного контроля 0,229). При контрольном двукратном (в соответствии с вышеуказанной "Инструкцией..."

НЗ СССР) исследования сыворотки,хра" нившейся при+4 С, установлено наличие антител к ВИЧ (подтвержденное в дальнейшем в ходе экспертного анализа методом вестерн-блот). Характерно, что уровень антител к ВИЧ в сыворот1554592 ке крови прогрессивно снижается по мере хранения при +4 C: при втором исследовании экстинкция составляет

1,044, при третьем, выполненном на следующие сутки после второго, 0,803. (экстинкции отрицательного контроля

0,119 и 0,140 соответственно).

У той же сбследуемой из пальца берут три порции крови по 0,02 мл, 10 вносят в три лунки планшета для иммунологических реакций и высушивают при комнатной температуре в течение

1 ч. В лаборатории в одну иэ лунок вносят О,1 мл растворяющей жидкости из комплекта тест-системы т1 едприя" тия "Антиген" и далее исследуют на наличие антител к ВИЧ в соответствии с инструкцией к тест-системе. Спек" трофотометрическая оценка результатов анализа показывает высокую вероятность наличия СПИД у обследуемой (экстинкция составляет 1,256, в от" рицательном контроле 0,159). Двукратное контрольное исследование выпол- 25 няют, используя две оставшиеся пробы высушенной с интервалом в 1 сут. Pe" зультаты анализа подтверждают наличие антител к ВИЧ в цельной капиллярной крови (экстинкции 1, 242 и 1, 227, отрицательный контроль 0,253 и 0,124 соответственно). При хранении проб высушенной крови на протяжении 2 сут содержание в ней антител к ВИЧ остается пра: тически постоянным, о чем свидетельствует динамика величин экстинкции.

Таким образом, сравнимые реэультаты анализа сыворотки и капиллярной крови, содержащих антите,ia к ВИЧ, ука- 0 эываат на отсутствие ложноотрицательных результатов при исследовании капиллярной крови.

Пример 2. У обследуемого

В.И. берут 3 мл крови иэ вены, центрифугируют при 3000 об/мин. для получения сыворотки, после чего сыворотку хранят при +4 С до момента исследования в ИфА с помощью тестсистемы предприятия "Антиген". на сле- 0 .дующие сутки 0,02 мл сыворотки вносят е лунку планшета для иммунологических реакций, растворяют в жидкости, находящейся в комплекте тест "системы, до разведения 1:100 и исследуют на наличие ВИЧ в соответствии q инструкцией к тест-системе. При спек трофотометрической оценке результатов ИфА величина экстинкции составляет 1,163, что свидетельствует о высокой вероятности наличия у обсле" дуемого СПИД (эксти нкция отри цател ьно" го контроля 0,164}. Однако при кон" трольном двукратном исследовании сыворотки, хранившейся при +4 С, с интервалом в 1 сут величины составляет (экстинкции) 0,219 и 0,187 cootветственно (в отрицательном контроле

0,210 и 0,154), что указывает .на отсутствие антител к ВИЧ в анализируемой сыворотке (подтвержденное в последующем в реакции иммуноблотинга) и, следовательно, на ложноположительный результат первого анализа.

У того же обследрванного иэ пальца берут три порции крови по 0,02 мл, вносят в три лунки планшета для иммунологических реакций и высушивают при комнатной температуре в течение

1 ч. В лаборатории в каждую иэ лунок вносят по 0,1 мп растворяющей жидкости иэ комплекта тест-сыстемы и далее исследуют на наличие антител к

ВИЧ в соответствии с инструкцией к тест-системе. Спектрофотометрическая оценка результатов анализа показала отсутствие антител к СПИД в пробах крови (экстинкции составили 0,363, 0,229 и .0,258 соответственно, в отрицательном контроле 0,200).

Следовательно при анализе высушенных проб капиллярной крови ложноположительный результат не установлен.

Доказательство получения положительного эффекта.

1. Анализ чувСтвительности иммуноферментного выявления антител к ВИЧ при подготовке пробы по заявленному способу и способу-прототипу в соот-, ветствующем биологическом материале

25 носителей вируса СПИД показал,что антитела к ВИЧ обнаружены в каждой пробе высушенной крови. Это свидетель" ствует о том, что подготовка проб 6иоматериала по предлагаемому способу не приводит к уменьшению чувствительности процедуры выявления в нем анти-, тел к ВИЧ.

2. Определение специфичности анализа при подготовке проб биоматериала по предлагаемому способу и способупрототипу осуществляют путем исследования сыворотки венозной крови и высушенных проб капиллярной крови 1145 обследованных доноров крови. Результаты сравнительного анализа представлены в таблице.

1554592

Количество и доля ложноположительных реакций в ИФА при использовании различных способов подготовки биоматериала

Анализируемый материал Количество Количество ложнополопроб жи тел ьных р ез ул ьта тов | 3

»» ав» ° a»»»w»»»»»»»»»»»»»»

Сыворотка венозной крови (способпрототип) 219 (18,8) 1145

Высушенная капиллярная кровь (предлагаемый способ) 28 (2,5) 1120

Таким образом, использование описываемого способа подготовки биоматериала позволяет получить положительный эффект - повышение специфической активности биоматериала, которое заключается: 1) в значительном уменьшеСоставитель Г. Крюкова

Техред И.Дндык Корректор С. Вевкун

Редактор Л. Герасимова акаэ 676 Тираж 292 Подписное

6НИИПИ Государственного комитета по изобретениям и.открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, N-35, Раушская наб., д. 4/5

Ю»

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул. Гагарина,!01

Иэ данных таблицы следует, uro ucncebaoeawe заявляемого способа под" готовки проб позволяет снизить количество ложноположительных результатов ИФА в 7,6 раза по сравнению со способом-прототипом (р с 0,001).

Применение предлагаемого способа позволяет добиться еще одного важного положительного результата: воэможности хранения проб биоматериала при комнатной температуре как минимум до 45 сут.

30 нии количества ложноположительных ре" эультатов анализа и 2) в обеспечении сохранности специфических антител в условиях, не требующих специальной ре фрижераторной техники на протяжении как минимум 45 сут.

Формула изобретения, Способ подготовки биологического материала для иммуноферментного анализа на СПИД путем забора материала и предварительной его обработки, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения специфической активности биоматериала, используют цельную кровь, причем перед анализом наносят ее на твердую фазу и высушивают прй комнатной температуре.