Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus, используемый для получения моноклональных антител к р @ - копропорфирину

 

Изобретение относится к гибридомной технологии. Штамм получен при гибридизации клеток селезенки мышей BAL в/с, иммунизированных коньюгатом "PD-копропорфирин 1-альбумин" с клетками мышиной миеломы SP 2/O-AG 14. секретирумые клетками штамма моноклональные антитела обладают высокой аффиностью K<SB POS="POST">D</SB> 4,6 <SP POS="POST">.</SP> 10<SP POS="POST">-1</SP>° M по отношению к PD-копропорфирину 1, что дает возможность использовать их в иммунофосфоресцентном анализе в модификации "порфирин-антипорфирин". Штамм культивируется в стандартных условиях и может перевиваться в виде асцита. Штамм депонирован под номером ВСКК/П/ N256д. продуцируемые моноклональные антитела относятся к YGG 1 подклассу. Продуктивность в культуральной жидкости на 7 день культивирования 100 мкг/мл, в асците 10 - 12 мг/мл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

3ИЙЙ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

110 ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ П(НТ СССР

1 (21) 4487868/30-13 (22) 28.07.88 (46) 07.05.90. Бюл. У )7 (71) Институт биохимии им. А.Н.Баха

АН СССР (72) М.В.Демчева, Т.В.Чередникова, Д.Б.Папковский и А.P..Ñàâèöêèé (53) 663.632.46(088.8) (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MJS MUSCULUS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЮНОКЛОНАЛЬНЫХ

АНТИТЕЛ К Pd-КОПРОПОРФИРИНУ (57) Изобретение относится к гибридомной технологии. Штамм получен при гибридизации клеток селезенки мьппей

Ва1Ь/с, иммунизированных коньюгатом

"Pd-копропорфирин 1-альбумин" с клетИзобретение относится к гибридомной технологии.

Штамм получают следующим образом, Дпя иммунизации используют конью гат РЙ-копропорфирина ? с бычьим сывороточным альбумином. 4-недельных мьппей линии Ва1Ь/с иммунизируют в течение месяца 3 раза 30 мкг антигена. При первой иньекции раствор антигена суспендируют в равном объеме адьюванта Фрейнда, последующие инъекции проводят без него. Титр антител в сыворотке крови животных, определяемый методом ELISA, составляет

1:15000. За 4 дня до слияния мышей иммунизируют раствором антигена в фи.— зиологическом растворе. Через 4 дня у мьппи извлекают селезенку в стерильных условиях, гомогенизируют в физиологическом растворе, содержащем

„„ЯО„„3562353 А 1 ($I}5 C 12 N 5/00" А 61 К 39/395

f 2 ками мьппинои миеломы Sp2/О-Ag l4..

Секретируемые клетками штамма моноклональные антитела обладают высокой аффиностью К g 4,6-10 oÌ по отношению к Pd-копропорфирину I, что дает возможность испольэовать их в иммунофосфоресцентном анализе в модификации "порфирии-антипорфирин", Штамм культивируется в стандартных условиях и может перевиваться в виде асцита. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) 256Д. Продуцируемые моноклональные антитела относятся к

У80 I подклассу. Продуктивность в культуральной жидкости на 7 день культивирования - 100 мкг/мл, в асци- а те — 10-12 мг/мл. ф

10Х глюкозу, и оставляют стоять 3 мин.

Грубый осадок отбрасьФают, а взвесь фпщй клеток переносят в центрифужный ста- ф кан и центрифугируют 8 мин при 800 8. ф

Надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок суспендируют в 50 мл физио- е логического раствора, содержащего глюкозу, снова центрнфугируют в тех © же условиях. Эту операцию повторя- © ют 2 раза.

Аналогичным образом промывают

3 раза физиологическим раствором миеломные клетки мыши линии Sp2/О. После этого селезеночные клетки смеши-. вают с миеломными в соотношении 10:1 и осаждают их центрифугированием, Надосадочную жидкость сливают и к осадку медленно по каплям добавляют 1 мп

503-ного полиэтиленгликоля в физи ологическом растворе, содержащеro 10Х диметилсульфоксида. Через 3 мин мед.ленно в течение 5 мин добавляют физиологический раствор, содержащий глюкозу, до объема 50 hIJI. Клетки осаж -. дают центрифугированием и осадок сус-. пендируют в среде Игла, модифицированной Дульбекко (ДМЕМ), содержащей !ОХ сыворотку крови оленей., 3,5 мМ глютамин, 17,5 мкМ пируват натрия, 50 мкМ !g

2-меркаптоэтанол, 100 мкМ гипоксанТИЯ» 6 МКМ ТИМИДИН» -» МКМ ЯМИНО» терни. Клетки распределяют в пяти 96», луночньы микропланшетах и культиви-. руют в СО -инкубаторе при 37 С в ат-ф

« мосфере 5ь СО>. Через 5 дней кл тки подкармливают, убирая иэ каждой лун. ки эО мкл среды и добавляя 50 мкл свежей.

Через Д«ве недели после сл»тания .проводнт тестирование гибридом на на" личие моноклональных антител методом ,непрямого твердофазного иммуноферментногр анализа, используя Для сорб- ции на полистиролавых микропланше- 25 тах коньюгат Рд-копроп»зрфирина с сое=вым ингибитог.оь» трипсина. Клетки., положительные Iro результатам тестирования, помещают B среду, содержащую все указанные компоненты, эа исключе=- .:,; нием аминоптерина (НТ-среда), Клетки наращивают в 24-луночньгх микропланшетах, часть из них эамораживают„ а остальные клонируют в полужидком агаре. Клонирование гибридомы повторяют

) трижды. Клонированную гибридому перевивают на мьш!ах Ва1Ь/с с пельш получения асцитной жидкаст:;,.

Полученный штамм гибридных клеток

ЗД, бЕ.26, синтезирующий моноклональ- 0 ные антитела к Pd-копрогк1рфирину,, денонирован в специализированной коллекции перевиваемых соматических кле--. ток позвоночных Всесоюзной коллекции клеточных культур Института цитологчи АН СССР под !!ВСКК(П) 256Д и характеризуется следующими свойствами.

Культуральные свойства. ,Для выращивания штамма используют культуральные флаконы. ВО флакон объемом 25 мл в 3 мл средь» ф%М, cоoдержащей 1ОЕ фетальной сыворотки„.

3,5 мМ глютамин, 17,5 мкМ пируват натрия, засевают 25ООЭО клеток гибри- домы 3D.бЕ.2G и проводяг пассажи

4", .„

1 раз в 4-5 дней с подсчетом клеток,.

Дпя получения асцита мышам Ва1Ь/с зэ. .7 дней до введения гибридомньгл клеток вводят 0,5 мл 2, 6, 10, 14-тетраметилпентадекана в/б. На 7 день штамм клеток инъецйруют в/б в количестве

500000 клеток в мышь. Асцитную жидкость отбирают на 12-14 день. Объем асцита 4-5 мл. Клетки из асцита .перевиваются новым мышам в течение 810 нассажеи без заметного изменения титра МОноклональных антител B асцит

НОЙ жидкО с ти, Продуктивность штат а, Концентрация моноклональных антител в культуральноЙ жидкОйти на

7 день культивирования 100 икг/мл, а в асцитной жидкости 10-!2 мг/мл при определении по методу Лоури и методом твердофазного иммуноферментного анализа.

Контаминация: бактерии и грибы в культуре не обнаружены, Тест на микоплазму отрица"гелен.

Кариологическая характеристика штаыча: модальное число хромосом 100.

Маркерных xpoMocoh» HB Выявлено.

V .риоконсервирование. Клетки штамма (500 тыс/мл) ресуспендируют в (м си содержс«щеи ОЖ эмбриОнальнои Геля чьей сыворо гкиу О/о Диметилсуль» фоксида, 602 Д»!ЕМ при 4 С, затем разливают в пластиковые ампулы и помеща.; ют в контейнеры из полиуретана. Контеинеры переносят в холодильник на

-7 С на 2» ч. Затем клетки переносят в жидкий азот на длительное хранение

Размораживание проводят в водяной бане при 37 С. Жизнеспособность клеток 70_#_.

Характеристика полезного продухта.

Моноклональные антитела относятся

z IgG I подклассу иммуноглобулинов.

Изоэлектрическая TowCB IIo Основной полосе соответствует 6,8. ффинную константу определяют слеA дующим образом.

В лунках 96-луночного микропланшета из полистирола иммобилиэованы аффинно очищенные моноклональные антитела. К ним добавляют одновременно .различные концентрации копропорфири- на Х и постоянная концентрация коньюгата копропорфирина 1 с пероксидазой в ФБРТ. Коньюгат получен присоединекием порфирина к белку с помощьк» 1циклогексил-3-(2-.морфолиноэтил) карбодиимида-и-толуолсульфоната. Реакционную смесь инкубируют 1 ч при

37 C

7, затем ее переносят в пробирки и оценивают количество несвязавшего1562353

Минимальная концентрация инсулина, определяемая с помощью иммунопероксидазного ПАП метода соответствует 1 10 М при одинаковых условиях проведения анализа.

Использование гибридомы позволяет получать моноклональные антитела, специфичные к Pd-копропорфирину.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ВСКК(П)

256Д, используемый для получения моноклональных антител к Pd-копропорфирину.

Составитель А.Маныкин

Редактор Н.Гунько Техред М,Ходанич Корректор C.×åðíè

Заказ 1037 Тираж 496 Подписное

BHHHIIH Государственног» комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина,101 ся с моноклональными антителами копропорфирина 1 спектрофотометрически.

Константа диссоциации равна 4,8 10 М.

Специфичность моноклональных антител оценивают методом твердофазного иммуноферментного анализа в следующей системе, 10

Очищенные методом жидкостной хроматографии высокого давления моно- клональные антитела адсорбируют на поверхности полистирола. Затем к адсорбированным антителам добавляют изменяющиеся концентрации порфиринов и постоянную концентрацию Pd-копропорфирина I. меченного пероксидазой (1,56-10 "М) в ФБРТ. Различные порфирины раститровывают от 10 ро 10 М, 20 а белковые коньюгаты порфирина— от 10 до 10 М, В качестве контроля служат лунки с Pd (2+) копропорфирин-пероксидаэой и буфером. Концентрации, при которых наблюдается

:503 ингибирование, связывание коньюгата Pd (2+) копропорфирин I пероксидаза со свободным Pd (2+) копропорфирином I u его производными, следующие, М: Pd-копропорфирин I 2,69х 30 х10 ; Zn-копропорфирин I 1,32 -10 ; копропорфирин I 3,16.10 ; копропорфирин ЕЕЕ 1,66 1Ф; цикло-Pd-копропорфирин 6,31 10 : гематопорфирин I

5 "10 ; Pd-копропорфирин I -"соевый ,ингибитор трипсина 2,39 10 ; Pd-коп ропорфирин I — бычий сывороточный а альбумин 1 69 !О

Как видно из приведенных данных, антитела с высоким сродством связыва- 40 ются со свободным Pd (2+)-копропорфирином. Замена атома Pd (2+) на атом

Zn (2+) ухудшает связывание в 1000 раз, а с копропорфирином без металла связывание уменьшается в 100 раз, 45

Менее прочное связывание моноклональных антител с копропорфирином ЕЕЕ, циклическим копропорфирином, гематопорфирином IX и протопорфирином IX свидетельствует о том, что моноклональные антитела чувствительны к природе боковых заместителей порфиринового кольца, П р и и е р, Моноклональные антитела, синтезированные штаммом 3D, 6Е, 2G, используют для разработки схемы фосфоресцентного иммуноаналиэа инсулина. Дпя этого смесь моноклональных антител к инсулину (6 10 9 Y) с инсулином (1,75 ° 10 М вЂ” 5 10 "М) инкубируют в лунках микропланшета с предварительно адсорбированным инсулином в течение l ч при 37 С в ФБРТ. В качествс контроля служит микропланшет, на поверхности которого адсорбирован бычий сывороточный альбумин, Затем планшеты отмывают ФБРТ и инкубируют в течение 1 ч с кроличьи и антимышиными антителами (6 10 > М) и насыщающей концентрацией комплекса моноклональные антитела — Pd (2+)-копропорфирин I. После отмывания сорбированного на полистироле комплекса проводят его десорбцию и измерение фосфоресценции.

Минимальная концентрация инсулина, определяемая в данной схеме, приблизительно равна 2 IF М. (