Штамм гибридных культивируемых клеток животных мus мusсulus, используемый для получения моноклональных антител к гормону роста крупного рогатого скота

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения моноклональных антител с помощью культуры соматических гибридных клеток. Цель изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток животных, продуцирующего моноклональные антитела (МонАТ) к гормону роста крупного рогатого скота с высокой продуктивностью. Штамм получают гибридизацией клеток селезенки мышей линии BALB/с, иммунизированных гормоном роста крупного рогатого скота, с клетками миеломы Х-63 АГ8653. Клетки культивируют в среде RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Клетки пассируют 2 раза в неделю, кратность рассева 1:5, концентрация клеток для посева 5<SP POS="POST">.</SP>10<SP POS="POST">4</SP>/мл. Штамм продуцирует МонАТ, специфичные гормону роста крупного рогатого скота. Секреция МонАТ на 3-4 день культивирования составляет 20 мкг/мл в культуральной среде и 15-20 мг/мл в асцитической жидкости. Штамм ВСКК (II) N240Д продуцирует МонАТ, которые могут быть использованы для выявления гормона роста крупного рогатого скота.

СОЮЗ СООЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

mCnVБЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Культуральные признаки.

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНР1п1ТИЯМ

ПРИ ГННТ СССР

1 (21) 4456475/31-13 (22) 06.07.88 (46) 15.05.90, Бюл. М- 18 (71) Институт молекулярной биологии им. В.A. Энгельгардта АН СССР (72) И.А. Прудовский, П.M. Рубцов, Е.М, Капник, А.В. Зеленин, К.Г. Скрябин и А.А. Баев (53) 578.085.23 (088.8) (56) Krivi G.G. and Rovold Е.

Hybridoma, 3, 1984. Р 2, р. 103-124. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ МПБ МПБСШ.П$, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ

АНТИТЕЛ К ГОРМОНУ РОСТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА (57) Изобретение относится к биотехнологии и касается получения моноклональных антител с помощью культуры соматических гибридных клеток.

Цель изобретения — получение штамма гибридных культивируемых клеток жиИзобретение относится к биотехнологии и касается получения моноклональных антител с помощью культуры соматических гибридных клеток.

Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируе-, мых клеток животных, продуцирующего моноклональные антитела (МонАТ) к гормону роста крупного рогатого ско-е та с высокой продуктивностью.

Штамм получают следующим образом.

Клетки мьппиной миеломы Х-63АГ

8653 гибридизуют с клетками селеэен„„SU„„1564184 А 1 (5I)5 С 12 N 5/00; А 61 К 39/395 2 вотных, продуцирующего моноклональные антитела (МонАТ ) к гормону рост та крупного рогатого скота с высокой продуктивностью. Штамм получают гибридизацией клеток селезенки мьппей линии BALB/ñ, иммунизированных гормоном роста крупного рогатого скота, с клетками миеломы Х-63 АГ8653.

Клетки культивируют в среде RPMI1640 с добавлением 107. эмбриональной телячьей сыворотки. Клетки пассируют 2 раза в неделю, кратность рассева 1:5, концентрация клеток для посева 5 .10 /мл. Штамм продуцирует

МонАТ, специфичные гормону роста крупного рогатого скота, Секреция

МонАТ на 3-4 день культивирования составляет 20 мкг/мл в культуральной среде и 15-20 мг/мл в асцитической жидкости. Штамм ВССК (П) II- 240P продуцирует МонАТ, которые могут быть использованы для выявления гормона роста крупного рогатого скота. пюаб ки мьппи линии BALB/Ñ, иммунизированны- 00 ми гормоном роста крупного рогатого пВ скота. В результате селекции полученных гибридных клеток на среде ГАТ, приготовленной на основе среды

RPMI-1640 с добавлением 102 эмбрио.нальной телячьей сыворотки отбирают штамм ИМБ 2/3, стабильно продуцирую- 3, щий)МонАТ к гормону роста крупного . рогатого скота. Штамм депонирован

: под номером ВСКК (П) М 240Д.

1564184

Среда культивирования RPNI" 1640 или DNEN сыворотка - эмбриональная телячья или телячья, антибиотикгентамицин (40 мкг/мл). Тип роста— миеломный, способ культивирования—

5 суспензионный. Возможно культивирование как в платах, так и в герметически закрытой посуде. Частота пассирования — 2 раза в неделю, кратность рассева — 1:5, концентрация клеток при посеве 5 ° 10 /хп. Количество произведенных пассажей - 30.

Продуктивность штамма.

Первичная культура моноклональна.

Проведено два клонирования, Все клоны позитивны. На протяжении 30 пассажей клона ИИБ 2/3 интенсивность продукции антител не изменяется (титр антител по ELISA в культуральной среде 10+-40, а в асцитической жидкости ) 10 ), Содержание антител в асцитической жидкости 15-20 мг/мл.

Контроль видимой специфичности. 25 а, Прививаемость мышам BALB/C. б. Продукция мьппиных иммуноглобулинов (антител против гормона), видовое происхождение которых показано с помощью кроличьих антител к мьппи- О ным иммуноглобулинам.

Консервация.

Среда для замораживания — бычья или телячья сыворотка + 102 ДМСО.

Режим замораживания — на программном замораживателе С/мин до -70 С, затем перенос в жидкий азот и хранение в нем.

При размораживании клеток после хранения в жидком азоте ампулы быстро 40 о переносят в водяную баню при 37 С, слегка покачивая. Содержимое ампулы стерильно переносят в подогретую питательную среду в ячейки платы с мако рофагамн, инкубируют при 37 С. После 4

20-24 ч инкубации среду сливают и добавляют свежую подогретую питательную среду.

Жизнеспособность после размораживания — 70 .

Контроль контаминаций.

Пров ерку н а мик опла э мени о е и 6актериальное заражение осуществляли с использованием флуорохромов Хехст

33258 и ДАПИ и посевом культуральной

«55 среды на мясопептонный; агар. Заражения не обнаружено.

Прививаемость животным изогенного происхождения — 1007.

Культура прививается и растет в виде асцита в перитонеальной полости мышей BALÇ/С. 3а 7 дней до введения клеток мьппам-реципиентам вводят по 0,5 мл пристана, Асцит образуется через 10-14 сут после введения

1-5 млн, клеток.

Использование штамма иллюстрируется следующим примером, Пример. Асцитическую жидкость центрифугируют при 15000 об/мин в течение 30 мин на центрифуге К-24, Осадок .отбрасывают, а супернатант используют в дальнейшей работе. После определения оптической плотности супернатанта при 280 нм (38,9 о.е./мл) его разбавляют буфером А (0,01 М натрий-фосфат, 0,15 M NaC1, рН 7,3) до оптической плотности 12 о.е./мл. С этой целью к 6 мл супернатанта добавляют 13,4 мл буфера А, Далее проводят осаждение иммуноглобулинов сульфатом аммония, добавляя к раствору

17,46 мл насыщенного при комнатной температуре раствора сульфата аммония, Смесь перемешивают по холоду в течение 40 мин и оставляют при 4 С на ночь. Осадок отделяют центрифугированием при 15000 об/мин в течение 15 мин на центрифуге К-24, растворяют в 19,4 мл буфера А и повторяют осаждение иммуноглобулинов сульфатом аммония.

Осадок растворяют в 2,5 мл буфера

Б (0,02 M трис-НС1, 0,04 И НаС1, рН 7,9) и диализуют против буфера (2 смены буфера по 250 мл). Диализованный раствор наносят на колонку с

ДЭАЭ-целлюлозой (j1 = 4,5 см, S L

1,1 см ), уравновешенной буфером Б.

Колонку промывают буфером Б до полного выхода белков, не связываемых с ионообменником (пик 1). Далее проводят элюцию белков градиентом концентрации ЬаС1 от 0,04 до 0,5 M в 0,02 M трис-НС1 буфере, рН 7,3. Объем градиента составляет 64 мл, скорость нанесения и элюции 32 мп/ч, Полученные фракции анализируют с помощью электрофореэа в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия, а также иммуноферментного анализа, .

Антитела к гормону роста крупного рогатого скота выходят в пике 1.

Результаты очистки антител иэ асцитической жидкости: объем асцитической жидкости, взятой в опыт, 6 мл; концентрация белка в асцитической

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ВСКК (П) У 240Д, используемый для получения моноклональных антител к гормону роста крупного рогатого скота.

Составитель А. Маныкин

Редактор Л. Веселовская Техред Л.Олийнык КоРРектоР Т.Малец

Заказ 1139 Тираж 498 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина,101

5 1564 10 жидкости 32,4 мг/мл, суммарное коли-. чество белка, взятое в опыт 194 4 мг

Ф Ю суммарное количество белка во.фракции с колонки 96 8 мг; выход очищенного препарата антител из 1 мл асци5 тической жидкости 16 мг; выход очищенного препарата антител 503 от суммарного белка асцитической жидкоСти. l0

Таким образом, штамм стабильно продуцирует моноклональные антитела к гормону роста крупного рогатого скота. Эти антитела связываются как с IIPHPOPHblM гоРмономр таК.И с FDPMO 15

Ф ном, полученным генноинженерным спо4 6 собом. Титр антител в культуральной (10 -10 ) и в асцитической жидкости

5 () 10 ) весьма высок.

1 мл асцитической жидкости содер— жит 15-20 мг моноклональных антител к гормону роста крупного рогатого скота, Препарат однороден.