Способ выращивания клеток печени

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для выращивания культур клеток печени, пригодных для трансплантации в целях коррекции печеночной недостаточности. Цель изобретения - повышение эффективности прикрепления, роста и функционирования клеток. Для культивирования изолированных клеток печени используют носитель из нетканного распущенного углеродного сорбента, покрытого коллагеном или полилизином. Толщина носителя в пределах 3-10 мм, а объем сорбционных пор углеродного сорбента по бензолу 0,5-0,8 см 3/г. Выращивают клетки в глубинных условиях. Использование способа увеличивает в 6-10 раз количество культивируемых гепатоцитов, а выращиваемые на матрице гепатоциты функционируют как дифференцированные клетки печени.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

09) (1!) bi)S С 12 И 5/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ДВтоЕСК0МУ СВИДЕтЕЛЬСтВМ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ll0 ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫГИЯМ

ПРИ ГКНТ ССОР (21) 44161 07/30-1 3 (22) 26.04.88 (46) 15.07.90. Бюл. У 26 (71) Институт проблем онкологии им. P.Е.Кавецкого (72) Л.А.Осипова, Т.А.Алексеева, .

Н.И.Немлий, А.И.Быкорез, С.В.Михайловский и М.В.Абрамов (53) 578.085.23 (088.8) (56) Литвин Д.Ж. Способ культивирования диплоидных клеток на целлюлозных волокнах (Заявка PCT У 85/05375, 05.12.1985, 9 26) — Изобретения мира, 1986, в 62, и 7. (54) СПОСОБ ВЫРАЦИВАНИЯ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ (57) Изобретение относится к биотех- нологии и может быть использовано для выращивания культур клеток печени, Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для выращивания культур клеток печени, пригодных для трансплантации в целях коррекции печеночной недостаточности.

Цель изобретения — повьппение эффективности прикрепления, роста и функционирования клеток.

Носитель представляет собой углеродный сорбент низкой емкости (обьем сорбционных пор по бенэолу 0,50,8 см /г), структурированный в виде войлока толщиной 3-10 мм. Носитель стерилизуют кипячением в дистиллированной воде, пропитывают

0,02Х раствором коллагена или полилизина, высушивают в вакуумном супригодных для трансплантации в целях коррекции печеночной недостаточности.

Цель изобретения — повышение эффективности прикрепления, роста и функционирования клеток. Для культивирования изолированных клеток печени используют носитель из нетканного распушенного углеродного сорбента, покрытого коллагеном или полилизином.

Толщина носителя в пределах 3-10 мм, а объем сорбционных пор углеродного сорбента по бензолу 0,5-0,8 смэ /г.

Выращивают клетки в глубинных условиях. Использование способа увеличивает в 6- 10 раз количество культивируемых гепатоцитов, а выращиваемые на матрице гепатоциты функционируют как дифференцированные клетки печени. шильном шкафу стерильно, хранят при о

4 С в среде для культивирования.

Клетки выделенные из печени млекопитающих энзиматическим методом, суспендируют в питательной среде в концентрации 10 млн/мл, наносят каплями на предварит льно увлажненный питательной средой носитель.

Подготовленную таким образом матрицу с клетками переносят на чашки

Петри, выдерживают 15-20 мин СО— инкубаторе, добавляют питательную среду в избытке и продолжают культивирование в атмосфере с 5-77. СО> с ежедневной сменой среды.Неприкрепившиеся клетки удаляют с первой сменой среды. Увеличение площади поверхности за счет применения объ1578192

Суспензию гепацитов наносят на матрицу с помощью пипетки каплями из расчета 100 мкл на 10 мг сорбента, выдерживают 15-20 мин при 37 С в о

СО -инкубаторе, после чего в сосуды для культивирования добавляют избы55 ток среды и продолжают инкубацию в подходящих условиях. Среду меняют обычным способом ежедневно. Об эффективности прикрепления гепатоцитов суемных волокнистых материалов позволяет повысить полезную площадь культивирования без увеличения общего объема аппаратуры, а также улучшить

5 кооперативное взаимодействие культивируемых клеток печени. При этом особое значение имеет покрытие волокнистых материалов коллагеном или полилизином, улучшающим адгеэию гепатоцитов, а также емкость углеродного сорбента и толщина структурированной матрицы.

Способ иллюстрируется следующими ! примерами. 1 5

Пример 1. Клетки печени выделяют в стерильных условиях иэ ткани печени крысы последовательно,проточной перфузией раствором: 0,027 М цитрат натрия, 0,9 -ный хлористый нат- 20 рий, 0,05Х-ная глюкоза, 5 мг/л гепарии (рН 7,35), затем рециркуляцией

0,05Х-ной коллагеназы на растворе

Хенкса. Из суспензии изолированных клеток печени гепатоциты осаждают центрифугированием 50g 3 мин, суспендируют в среде для культивирования в концентрации 10 млн/мл. Среда для культивирования имеет следующий состав: среда Игла 10 -ный гид) ролизат лактальбумина, 20 -ная сыворотка крупного рогатого скота, антибиотики (по 100 мкг/мл среды пенициллина и стрептомицина).

Матрицу готовят следующим образом.

Углеродный сорбент с объемом сорбционных пор по бензолу 0,5 см /г, структурированный в виде войлока, толщиной 3 им стерилизуют кипячением в дистиллированной воде, пропи- 40 тывают 0,02Х-ным раствором коллагена, высушивают в стерильных условиях в вакуумном сушильном шкафу при о

37 С. Перед нанесением клеток матрицы переносят в сосуды для культивирования (чашки Петри), увлажняют средой для культивирования, избыток которой удаляют с помощью фильтровальной бумаги. дят по количеству . открепившихся клеток, выявляемых в среде на 2 — 3-тьи сутки после нанесения.

Количество неприкрепившихся клеток в от числа нанесенных составляет соответственно на 2-е и 3-и сутки культивирования 10,5 и 0,9 .. В данном варианте на 1 мг матрицы куль— тивируют 6,5-7,5 х 10 гепатоцитов.

Ф

Микроскопирование разъединенных на отдельные волокна матриц показывает, что гепатоциты растут хорошо, часть из них прикреплена непосредственно к волокнам, а основная масса клеток растет в виде агрегатов различных размеров в межволоконном пространстве.

Пример 2. Условия проведения эксперимента такие же, как и в примере 1, но матрицу готовят сле— дующим образом: стерилизованный кипячением войлочный сорбент с объемом сорбционных пор по бензолу 0,5 см /r, толщиной 3 мм пропитывают 0,02 -ным раствором полилизина и высушивают стерильно в вакуумном сушильном шкафу при 37 С. Количество клеток, не прикрепившихся при нанесении и выявленных в среде для культивирования на 2-е и 3-и сут, составляет соответственно 8,5 и 1Х от числа нанесенных.

В данном варианте на 1 мг матрицы, покрытой полилизином, культивируют 7-8 х 10 гепатоцитов. ф

П .р и м е р 3. Условия проведения эксперимента соответствуют примеру 1, а в качестве матрицы используют углеродный сорбент с объемом сорбционных пор по бензолу 0,5 смз /г, структурированный в виде войлока толщиной 3 мм, но без предварительного покрытия Коллагеном или полилизином.

При этом количество клеток, выявленных в среде для культивирования на 2-е и 3-и сут после нанесения, составляют соответственно 32 и 35Х от числа нанесенных. Следовательно, данный вариант матрицы, не покрытой коллагеном или полилизином, непригоден для культивирования гепатоцитов.

Пример 4. Условия проведения эксперимента соответствуют примеру 1 за исключением толщины матрицы, составляющей 5 мм и объемом сорбционных пор по бензолу 0,5 см /г. Количество гепатоцитов, не прикрепившихся при

92 б патоцитов составляет 23,5, в последующем также отмечается открепление значительного числа клеток, ство клеток печени, культивируемых по предлагаемому способу, в 6- 10 раз выше, чем в известных способах, основанных на выращивании клеток на плоских или сферической формы подложках. Культивируемые на матрицах гепатоциты могут быть трансплантированы в брюшную полость сингеHHbBi животным с экспериментальной желтухой, что позволяет также оценить жизнеспособность и функциональную активность высокодифференцированных клеток печени, растущих на матрицах, по коррекции печеночной недостаточности у животных-рецепиентов.

Формула изобретения

Способ выращивания клеток печени путем глубинного культивирования в питательной среде, о т л и ч а ю— шийся тем., что, с целью повышения эффективности прикрепления, роста и функционирования клеток, культивирование ведут на матрицах толщиной в 3-10 мм, выполненных из нетканого распушенного углеродного сорбента с объемом сорбционных пор по бензолу 0,5-0,8 см /г, предварительно покрытого коллагеном или полилизином.

Составитель А.Маныкин

Редактор М.Недолуженко Техред М.Xоданич

Корректор М.Самборская

Заказ 1891 Тираж, 490 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101

15781 нанесении и выявленных в среде для культивирования, составляет соответственно 8 и ЗХ от числа нанесенных. В данном варианте на 1 мг матрицы, представляющей собой структурированный в виде войлока толщиной 5 мм углеродный сорбент, культивируют 7,58,5 х 10 гепатоцитов.

Пример 5. Условия проведения эксперимента соответствуют примеру 1 за исключением толщины матрицы, составляющей 8-10 мм, из углеродного сорбента с объемом сорбционных пор по бензолу 0,5 см /г. При этом . количество гепатоцитов, не прикрепившихся при нанесении и выявленных в среде для культивирования на 2-е и

3-и сут культивирования, составляет соответственно 12 и 19Х от числа 20 нанесенных, а количество культивируемых гепатоцитов 5,5-6,0 х 10 на кг.

4 матрицы.

Пример 6. Условия проведения эксперимента, как в примере 1, за 25 исключением того, что углеродный сорбент, используемый в качестве матрицы, обладает объемом сорбционных пор .по бензолу 0,8 смэ /г и толщиной 3 мм.

Количество неприкрепившихся при нанесении и выявленных в среде для культивирования гепатоцитов составляет на 2-е и 3-и сут культивирования

5,5 и OX от числа нанесенных, В данном варианте на 1 мг матриць1 кульФ тивируют 9-10 х 10 гепатоцитов.

Пример 7. Условия проведения эксперимента соответствуют примеру 1 за исключением того, что углеродный сорбент, используемый в ка-.

40 честве матрицы, обладает объемом сорбционных пор по бензолу 1,2 см /г и толщинбй 3 мм. Количество не прикрепившихся при нанесении и выявлен-. ных в среде для культивирования геТаким образом, использование углеродных сорбентов низкой емкости, структурированных в виде войлока толщиной

3- tO мм, покрытого предварительно коллагеном или полилизином, позволяет осуществить прикрепление и глубинное культивирование значительного количества изолированных клеток печени в малом объеме носителя. Количе