Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus, используемый для получения моноклональных антител к @ - интерферону человека

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для определения содержания γ-интерферона в биологических жидкостях и в культуральной среде. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных MUS MUSCULUS, продуцирующего моноклональные антитела (Мон АТ), специфичные к γ-интерферону человека. Штамм получают гибридизацией клеток селезенки мышей, линии BALB/с, иммунизированных рекомбинантным γ-интерфероном человека, с клетками миеломы SP2/О AG 14. Клетки культивируют в среде RPMI 1640 с добавлением некоторых аминокислот, а также 50 мкМ 2-меркаптоэтанола и 10% сыворотки плода коровы при 37°С в атмосфере 5% CO<SB POS="POST">2</SB>. Клетки пассируют 2-3 раза в неделю

кратность рассева 1:2. Штамм продуцирует Мон АТ, относящиеся к классу IG G. Секреция Мон АТ на третий-четвертый день культивирования составляет 3-10 мкг/мл среды и 3-5 мг/мл асцитической жидкости. Мон АТ специфически взаимодействует с γ-интерфероном человека, а также с рекомбинантным γ-интерфероном.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР йА(;„ ; . БЛИ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4456403/30-13 (22) 06.07.88 (46) 15.06.90, Бюл. ¹ 22 (71) Институт цитологии АН СССР (72) О.Ю.Антропова, В.В.Барловская, В.И,Воробьев, К.И.Галактионов, В,А.Иванов; Б.А.Маргулис, Г.П.Пинаев и И,И.Фридлянская (53) 578.085.23 (088,8) (56) Т.lmmun. Meth. 79, 1985, р. 293-305. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМ ЫХ КЛ ЕТО К ЖИ ВОТН ЫХ MUS

MUSCULUS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К

1г-ИНТЕРФЕРОНУ ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для определения содержания у -интерферона в биологических жидкостях и в культуральной среде. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для определения содержания у -интерферона в биологических жидкостях и в культуральной среде.

Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus — продуцента моноклональных антител (Мон AT), специфичных к у-интерферону человека.

Штамм получают следующим образом.

Клетки мышиной миеломы SP2/О. Ag 14 гибридизуют с клетками селезенки мыши линии BALB/с, иммунизированной рекомбинантным у -интерфероном человека по схеме, обеспечивающей максимальный им. Ж,, 1571003 А1 (я)л С 12 N 5/00, А 61 К 39//3395 клеток животных Mus musculus, продуцирующего моноклональные антитела (Мон AT) специфичные. к у-интерферону человека.

Штамм получают гибридизацией клеток селезенки мышей, линии BALB/С, иммунизированныхых рекомбинантн ым у-интерфероном человека, с клетками миеломы SP2/0

Ag 14. Клетки культивируют в среде RPM1

1640 с добавлением некоторых аминокислот, а также 50 мкМ 2-меркаптозтанола и

10, сыворотки пледа коровы при 37 С в атмосфере 5% COz. Клетки пассируют 2-3 раза в неделю; кратность рассева 1:2, Штамм продуцирует Мон AT, относящиеся к классу lgG. Секреция Мон AT на третий-четвертый день культивирования составляет

3-10 мкг/мл среды и 3-5 мг/мл асцитической жидкости, Мон AT специфически взаимодействуют с у интерфероном человека, а также с рекомбинантным у-интерфероном. мунный ответ для слабых антигенов. Предварительно подбирают оптимальные условия для слияния спленоцитов с клетками миэломы, что обеспечивает высокую степень гибридизации клеток. В результате селекции полученных гибридных клеток на среде ГАТ, скрининга гибридов по признаку продукции антител к у -интерферону и последующего клонирования отбирают штамм

159Д (авторское наименование у -745), стабильно продуцирующий Мон AT к у-интерферону.

Штамм хранится в специализированной коллекции клеточных культур Института цитологии АН СССР— ВСКК(П). Регистрационный номер депонирования 159Д. К моменту

1571063 депонирования штамм продуцирующий

Мон AT øåë 15 пассажей.

Культуральные признаки, Стандартные условия культивирования — среда RPM1 1640 с добавлением следующих аминокислот, мг на 1 л среды: L-аланина

8,9; 1=аспарагина; Н О 15,0; -аспарагиновой кислоты 13,0; глицина 7,5; -глютаминовой кислоты 14,7; L-пролина 11,5; L-серина

10,5, а также 50 мкм 2-меркаптоэтанола и

10% сыворотки плода коровы.

Клетки культивируют в пластиковой или стеклянной посуде в закрытой системе или в атмосфере 5%-ной СО при 27 С. При росте на указанной среде штамм образует округлые клетки. Время удвоения популяции

24-30 ч. Клетки пассируют 2-3 раза в неделю. Кратность рассева 1:2.

Культивирование в организме животных. Прививка гибридных культивируемых клеток штамма 159Д сингенным мышам линии BALB/с вызывает у них образование асцитной опухоли, В асцитной жидкости содержатся Мон AT ку-интерфероны. Способность к продукции Мон AT стабильно сохраняется на протяжении по крайней мере 15 пассажей в культуре и 2 пассажей при перевивках на животных(срок наблюдения), а также при переводе асцитных клеток на обычную ростовую среду. Штамм продуцирует Мон AT, относящиеся к классу IgG, Продуктивность штамма.

При стандартных условиях культивирования штамма 159Д продуцирует Мон AT в количестве 3-10 мкг/мл среды в зависимости от условий культивирования. Решающее значение имеет качество сыворотки плода коровы.

При культивировании штамма 159Д in

vlvo от одной мыши можно получить 3-7 мл асцитической жидкости (в среднем 5 мл) с содержанием Мон АТ к у --интерферону 3-5 мг!мл (в среднем 4 мг/мл), Для получения больших количеств Мон

AT целесообразно использовать культивирование штамма In vivo с последующим извлечением Мон АТ из асцитической жидкости.

Криоконсервация проводится в смеси равных объемом кондиционированной ростовой среды и 20 -ного диметилсульфоксида на ростовой среде при концентрации

0,5 -1 10 клеток в 1 мл. Режим заморажи6 вания: 1 в мин от 20 до минус 60 С, 10 в мин от минус 60 до 100 С, 50 в мин от минус 100 до минус 150 С. Клетки хранят в жидком азоте. Отогревают при 40 С в течение 1-2 мин; далее разбавляют 10-кратным объемом среды, центрифугируют 5 мин при

1000 об/мин и высевают в ростовую среду, Жизнеспособность клеток штамма 159Д после размораживания, определенная по включению трипанового синего, 60-70%.

Контаминация. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены, Микоплазма не выявлена по включению тимидиновой метки.

Пример, Каждая мышь линии BALB/с предварительно получает внутрибрюшинно по 0,5 мл пристана. Через 8-10 дней подготовленным таким образом животным внутрибрюшинно вводят гибридные клетки, полученные иэ асцитической жидкости мышей — носителей опухоли. Для этого из брюшной полости мыши извлекают 5,2 мл асцитической жидкости, которую стерильно центрифугируют 7 мин при 1000 об/мин на центрифуге К-23. Осадок клеток отмывают стерильным фосфатным буферным раство20 ром (0,02 Мфосфатный буфер с 0,,14 M NaCI, рН 7,2) и повторно центрифугируют в том же режиме. Осадок ресуспендируют в 1,5 мл фосфатного буфера и проводят подсчет клеток в камере Горяева, Каждой иэ трех взятых

25 в опыт мышей вводят 2,5х10 клеток в объеме 0,5 мл. Спустя 9 дней мышей забивают и из брюшной полости извлекают асцитическую жидкость. Всего от трех мышей получено 14,9 мл асцитической жидкости (3,8+ 4,9

30 + 6,2), Клетки из асцитической жидкости отделяют центрифугированием и используют для дальнейших перевивок гибридомы, а из насадочной жидкости извлекают Мон AT.

35 С помощью стандартного твердофазного иммуноферментного метода установлено, что полученная асцитическая жидкость содержит Мон AT к у- интерферону. К препарату у -интерферона, собированному

40 в лунках платы для иммунологических исследований, добавляют разведенную асцитическую жидкость. После инкубации и соответствующих отмывок в лунки добавляют коньюгированные с перексидазой хрена

45 кроличьи антитела и против мышиных иммуноглобулинов, По окончании фермента° тивной реакции расцепления HzOz в присутствии диаминобензимида развивающуюся окраску регистрируют на спектрофотометре

50 Мультискан придлине волны 450 нм. Связывание Мон AT с интерфероном обнаружено при разведении асцитической жидкости до

Для получения Мон AT из асцитической

55 жидкости иммуноглобулины осаждают сульфатом аммония до 50 насыщения. Осадок отделяют центрифугированием, растворяют в 20 мМ фосфатного буфера с 0,14 M NaCI u обессоливают на колонке РД 10. Белковый

1571063

Составитель А.Маныкин

Техред M. Mîðãåíòàë Корректор Н,Ревская

Редактор О.Спесивых

Заказ 1487 Тираж 503 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 раствор наносят на колонку моно QHR 5/5, являющуюся частью системы быстрой жидкостной хроматографии. За один проход из раствора иммуноглобулинов, соответствующего 0,5 мл асцитической жидкости, элюируют 2 мг Мон AT. Таким образом, при культивировании гибридомы штамма 159Д в виде асцитной формы опухоли выход Мон

AT около 20 мг/мышь.

Характеристика Мон AT, продуцируемых штаммом гибридомы 159Д.

Мон AT, секретируемые в асцитическую жидкость клетками гибридомы штамма

159Д, связываются как с нативным у-интерфероном человека, полученным из донорской крови, так и с рекомбинантным

7 интерфероном, полученным от бактериальных процуцентов, Связывание Мон AT c указанными препаратами ) -интерферона установлено в тесте твердофазного иммуноферментного анализа, а также методом иммуноблотинга.

По данным электрофореза в полиакриламидом геле Мон AT, продуцируемые клетками гибридомы штамма 159Д, относятся к классу IgG.

Характерной особенностью Мон AT, продуцируемых гибридомой 159Д, является то, что они узна)от в молекуле рекомбинантного у-интерферона эпитоп, локализованный вне С-концевой последовательности из

15 аминокислот.

5 Другая особенность Мон AT состоит в том, что они оказываются способными взаимодействовать с у-интерфероном, уже сорбированным на других Мон AT (полученных от гибридомы штамма 158Д). Это обстоя10 тельство открывает возможность использования антител, продуцируемых штаммом гибридомы 159Д, для изготовления тест-набора для количественного оп ределения у-интерферона в биологических жидкостях и

15 культуральной среде. При этом Мон AT, продуцируемые штаммом 159Д, должны использоваться в иммуноферментном или радиоиммунном методах анализа в качестве вторых (верхних) или индикаторных антител

20 в виде конъюгата с ферментом или с радиоактивной меткой.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых кле25 ток животных Mus musculus ВСКК(П)-159Д, используемый для получения моноклональных антител к у -интерферону человека.