Способ получения микроносителей для культивирования клеток

 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению клеточных культур. Целью изобретения является упрощение способа и повышение выхода жизнеспособных клеток. Микроносители получают механическим раскалыванием желатина до заданных размеров в присутствии жидкого азота, их гидратирование проводят одновременно с отмывкой и калибровкой с помощью солевых растворов или дистиллированной воды, обработку 25%-ным раствором глутарового альдегида ведут из расчета 0,2 - 0,4 мл реагента на 1 г сухого желатина с последующей отмывкой дистиллированной водой. На микроносителях, полученных данным способом, культивируют клетки разных типов перевиваемых линий и первично трипсинизированные. Через 38 - 60 ч культивирования на поверхности микроносителей образуется плотный пласт клеток, который может длительно удерживаться на поверхности гранул микроносителя (более 120 ч).

Изобретение относится к биотехнологии и имеет отношение к получению клеточных культур. Целью изобретения является упрощение способа и повышение выхода жизнеспособных клеток. П р и м е р 1. 50 г пищевого желатина помещают в камеру, покрытую теплоизоляционным слоем, и заливают 50-100 мл жидкого азота. С помощью пестика раскалывают желатин до получения осколков требуемого размера, например 70-300 мкм. Измельченный желатин промывают 3-4 раза фосфатно-буферным раствором (рН 7,2-7,4), при этом со смывами удаляют мелкие пылевидные частицы. Используя разную скорость оседания частиц, можно отделить и более крупные гранулы, которые возвращают в камеру для повторного раскалывания. После промывки, при которой происходят одновременно калибровка и гидратирование гранул, проводят стадию обработки сшивающим агентом, для чего к осадку добавляют 15 мл 25%-ного раствора глутарового альдегида. Смесь оставляют на 2-3 ч при комнатной температуре для полимеризации поверхностного слоя. Затем реагент удаляют путем слива и не менее 5-кратного промывания дистиллированной водой. В результате проведенной процедуры получают примерно 550 см³ микроносителей с линейными размерами гранул 100-400 мкм. П р и м е р 2. 50 г пищевого желатина размалывают в течение 3-4 мин между стальными дисками с регулируемым зазором при постоянной подаче в камеру жидкого азота (общий расход азота не превышает 200 мл). Полученные частицы промывают 3-4 раза дистиллированной водой. Далее процедуру повторяют, как описано в примере 1. В результате получают микроносители (общий объем около 600 см³) с линейным размером гранул 150-250 мкм. П р и м е р 3. 30 мл плотного осадка готовых микроносителей, полученных, как в примерах 1 и 2, стерилизуют автоклавированием (0,7 атм, 45 мин) в фосфатно-буферном растворе. Затем буфер удаляют и осадок промывают одноразово питательной средой. Если микроноситель хранится в этиловом спирте, то автоклавирования не производят, а перед употреблением его промывают несколько раз фосфатно-буферным раствором и питательной средой. К промытому микроносителю добавляют суспензию клеток ВНК-21 из расчета (0,6-0,7) ˙ 10⁷ клеток/см³ микроносителя и проводят адсорбцию в течение 5 ч. После прикрепления клеток к поверхности гранул всю систему клетки - микроноситель переносят в 5-литровый биореактор с перемешивающим устройством, доводят объем до 3,0 л, добавляя питательную среду с 10% сыворотки крупного рогатого скота, и проводят культивирование при известных условиях. Через 36-60 ч на поверхности всех гранул образуется плотный пласт клеток, который длительное время может удерживаться на микроносителях (более 120 ч). Аналогичным образом культивируют клетки других линий, например МДБК, ТR, ПО, ПТ-80, и первично трипсинизированные клетки. Таким образом, микроносители пригодны для культивирования различных типов клеток. Простота и технологичность способа делает данный микроноситель более доступным и дешевым по сравнению с известными, что позволит широко использовать его в ветеринарной и медицинской практике для производства клеточных культур и вирусов.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МИКРОНОСИТЕЛЕЙ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК, включающий приготовление желатиновых гранул и их обработку диальдегидом, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и повышения выхода жизнеспособных клеток, желатин механически раскалывают в жидком азоте, полученные гранулы гидратируют, обработку проводят 25%-ным раствором глютарового альдегида из расчета 0,2 - 0,4 мл на 1 г сухого желатина.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Номер и год публикации бюллетеня: 10-2002

Извещение опубликовано: 10.04.2002        

---