Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus l. - продуцент моноклональных антител к антигену кортикальных тимоцитов человека

 

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано в иммунодиагностики злокачественных новообразований. Цель изобретения - получение гибридомы, продуцирующей моноклональные антитела, выявляющие антиген на бластных клетках больных лейкозом. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) N313Д. Штамм получен соматической гибридизацией клеток мышиной миеломы Р3 .63AG 8.653 и клеток селезенки мыши BALB/C, иммунизированной тимоцитами человека. Мон АТ, продуцируемые гибридомой, относятся к JGM класса. Титр антител в культуральной жидкости 1:50 на протяжении 25 пассажей, в асцитной жидкости 1:10000 на протяжении 15 пассажей. Мон АТ реагируют в РИФ с 43,9±11,1% тимоцитов человека и не реагируют с клетками крови здоровых доноров.

СО)ОЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕО<ИХ

PECrJYSËÈК (19) (И) (51)5 С 12 N 5/00 А 61 К 39/395

:т .: 11мМ т

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Г ) (Г.Л),(О

Н А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ подвергшихся открытым операциям на сердце. Пятую иммунизацию проводят

Т-лимфоцитами периферической крови в дозе 2 ° 107 клеток. На 7-й день после последней иммунизации мышь забивают и в стерильных условиях извлекают селезенку . Селезенку измельчают в гомогенизаторе Поттера. Взвесь клеток фильтруют через 2 слоя марли и трижды отмывают средой 199 ° Клетки селезенки и клетки миеломы 73r63 Ag8.653 сливают в соотношении 10:1(9 ° 10 клеток селезенки; 9 10 клеток миеломы), смесь клеток отмывают один раз средой

199 и помещают в объеме 20 мл среды

199 во флакон объемом 100 мл. В этом флаконе клетки центрифугируют при

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

Il0 ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОЧ1(РЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4385236/30-13 (22) 29.02.88 (46) 07.07.90. Бюл. № 25 (71) Всесоюзный онкологический научный центр AHH СССР (72) А.JO Барышников, О.В ° Короткова и Н.Н.Тупицин (53) 578.085.23(088.8) (56) J. Immunology, 1987, v. 138, № 9, р. 2864-2868. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛГ1ТИВИРУЕГ(ЫХ

КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ ГП18 MUSCULUS L.

ПРОДУЦЕНТ Г1ОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К

АНТИГЕНУ КОРТИКАЛЬНЫХ ТИГ1ОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано в иммунодиагностике злоИзобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано в иммунодиагностике злокачественных новообразований.

Цель изобретения — получение гибридомы, пррдуцирующей моноклональные антитела, выявляющие антиген на "." бластных клетках больных лейкозом.

Штамм получают следующим образом.

Проводят соматическую гибридизацию клеток мышиной миеломы РЗ х 63Ая8. 653 и кле ток селе з ен ки мыши BALB/Ñ, иммунизированной тимоцитами человека. Мьпнь 4-кратно иммун из ируют внутривенно в дозе 2 -10" клеток с интервалом в 4 недели. Тимус получают от детей в возрасте от 1 r до 14 лет, 2

1 качественных новообразований. Цель иэобретеНия — получение гибридомы, продуцирующей моноклональные антитела, выявляющие антиген на бластных клетках больных лейкоэом. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) ¹ 313Д.

Штамм получен соматической гибридизацией клеток мьппиной миеломы

Р3х 63Ag8,65З н клеток селезенки мьппн

BALВ/С, иммунизированной тимоцитами человека. МонАТ, продуцируемые гибридомой, относятся к IgJ классу.

Титр антител в культуральной жидкости 1:50 на протяжении 25 пассажей, в асцитной жидкости 1:10000 на протяжении 15 пассажей. МонАТ реагируют в РИФ с 43,9+11,17 тимоцитов человека и не реагируют с клетками крови здоровых доноров.

3 15765

800 об/мин в течение 3 мин и инкубируют при. 37 С в течение 20 мин. Среду осторожно насухо отсасывают и добавляют 3 мл 50%- полиэтиленгликоля с мол. мас. 15000. Через 70 с во флакон вн а- " сят 20 мл среды 199. Клетки.3 раза отмывают центрифугированием, не встряхивая, и инкубируют 2 ч при 37 С в

20 мл среды роста (среда ВРИ1 1640, содержащей 15% телячьей,эмбриональной сыворотки, 2 мИ/мл глютамина, 0,1мг/мп интамицина. Затем клетки разливают по

0,2 мл в лунки плоскодонного 96-луначного плато, На следующей день среду роста заменяют иа селективную среду (среда роста, содержащая. О,i мИ гипоксантина, 5,8 мкМ. азасерина). Видилсые колонки появляются на 14-й день в 84 из 86 лунок. Проводы скрининг гибридом на тимоцитах человека. Скри20 нинг проводят в непрямой реакции по.верхностнойиммунофлуоресценции (РИФ) °

При обнаружении специфического свечения прагеряют реакцию антител с мононуклеарными клетками и гранулоцитами периферической крови здоровых лиц.

После тестирования выявлено, что 6 гибридных клонов реагируют только с тимоцитами. Одну из 6 гибридом клони— руот методом ограниченных разведений на фидере из клеток селезенки и тиму— са мьшсей BALB/Ñ.

Для приготовления физера кусочки т- муса и селезенки разрушают в стеклянном гомогенизаторе Поттера. Взвесь 35 клеток фильтруют через 2 слоя марли.

Суспензио клеток разливасот по 0,1 мл в лунки 96-луночного плоскодонного плато. Через 1-7 дней плато с клетками используют как фидер. При клониро — "0 ван ии клетки из продуцируюшей лунки снимают нежным пипетированием. Клетки разводят в среде роста до конечной концентрации 50 клеток в 10 мл среды и разливают по 0,1 мл в лунки на фи- 45 дер.

После первого клонирования колонки появляются в 22 -из 48 лунок на 16-й день. Проведено тестирование гибридам на тимоцитах человека. Антитела из

22 лунок реагируют с тимоцитами (позитивных клонов 100%). Проводят вто рое клонирование. Колонии возникают на 14-й день в 19 из 60 лунок. Проведен скрининг на тимоцитах человека. Пази- 55 тивных клонов после второго клонирования 100%.

Полученный штамм обозначен ИК0-44.

Штамм гибридных культивируемых клеток депонирован под номером ВСКК(П)

Р 313Д.

Культуральиые свойства. Стандартные условия выращивания.

Для выращивания штамма можно использовать стеклянную или пластмассовую посуду. Во флакон объемом 45 см" засевают по 5-105 клеток штамма в l0 мл среды. Пассаж 1 раз в 3-4 дня той же дозой, без подсчета клеток

1:3 — 1:4. Штамм выращивают при 37 С в атмосфере 5% СО< на среде КРИ1 1640 или среде MEM в 1Х модификации

Дульбекко, содержащей 15% телячьей змбрйональной сыворотки, 2 MM/ìë глюс амина, 0,1 мг/мл гептамицина.

Титр антител в культуральной жидкости определяют непрямой реакцией поверхностной иммунофлооресценции на живых тимоцитах. Интенсивность флюоресценции оценивасот на флюоресцентном микроскопе при увеличении объектива «40, окуляра 2,5-10.Титр антител в культуральной жидкости 1:50.

Культивирование in vivo. Для выращивания асцитной опухоли из штамма гибридных клеток пригодны мыши самки линии BALВ/С. Интактным мышам за 1-7 днеи до прививки опухоли вводят внутрибрюшинно (в/бр) па 0,5 мл 3%-ного пептана на вазелиновом масле. Клетки гибридомы инъекцируют в/бр по 10 кле7 так на мышь в 5 мл среды. Через 7-10 дней у мышей возникают асцитные опухоли. Культуру клеток гибридом поддеряивасот серийными пассажами асцитнай опухали. Титр антител в асцитной жидкости 1:10000.

Продуктивность. Стабильность продуцирования антител сохраняется на протяжении 25 пассажей на витра и 15 пассажей. ин вива. Титр антител в культуральной яипкости на протяжении 25 пассаяей составляет 1:50 — 1:10, в асцитной яидкости титр антител на протяжении 15 пассажей 1:10000 — 1:1000, Контаминация. Г>актерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на штатные среды.

Зарая нне микоплазмой не выявлено.

Криокансервирование. Клс.тки штамма ресуспендируют в среде RPM1 1640, содержащей 20% телячьей эмбриональной сыворотки. К сусгензии клеток добавляют 20% диметилсульфоксид да конечной концентрации 10%. Количество клеток на 1 ампулу объемом 1 мл составляет

10-20 < 10 . Замораживание проводят

6 при -70 С в течение 2 ч, затем ампу1576561

5 лы с клетками помещают в жидкий азот. Размораживание проводят при

+40 С в течение 70 с, Жизнеспособность клеток после размораживания по включению трипаноного.синего составляет 75-80%.

Характеристика целевого продукта.

Штамм гибридных культивируемых клеток продуцирует моноклональные антитела

EgI класса. Класс кчмуноглобулина определяют по методу Оухтерлони в реакции преципитации. С этой целью используют моноспецифические сыворотки против тяжелых цепей иммуноглобулинов мыши. Культуральную жидкость гибридомы концентрируют в 10 раз с помощью насыщенного сульфата аммония, диализируют и помещают в центральную лунку 17. al apa. В периферические лун-: 20 ки вносят антиглобулиновые сыворотки.

Через сутки образуется четкая полоса преципитации с сывороткой против IgH класса.

Специфичность монАТ ИКО-44 опреде— ляют в непрямой РИФ на различных типах клеток, прикрепленных к стеклу с помощью полилизина. В качестве монАТ используют культуральную или асцитическую жидкость штамма гибридных клеток ИКО-44.

Непрямой метод РИФ является двухэтапным. На первом этапе исследуемые клетки обрабатывают в течение 30 мин о при 20 С мовАТ. Клетки отмывают от антител средой 199. Па втором этапе клетки обрабатывают Г/ав/ — фрагмен2 тами, полученными из коммерческой кроличьей люминесцирующей сыворотки против глобулинов белой мыши, в течение 30 мин при 0 С. Процент антиген положительных клеток учитывают на флюоресцентном микроскопе под масляной иммерсией при унелечении объектива 90х100, окуляра х2,5-10.

МонАТ ИКО-44 реагируют в РИФ с

43,9 11,17. тимоцитон человека и не реагируют с клетками крови здоровых доноров.

Пример 1. В костном мозге больного с острым лимфобластным лейкоэом содержится 1007. бластных клеток. Костный мозг бального получают при стериальной пункции. Фенотип бластных клеток определяют в РИФ. Количества антиген — положительных клеток учитывают на флюоресцентном микроскопе при увеличении объектива к40, окулярах х10.

На 367. бластных клеток определяется антиген выявляемый манАТ ИК0-44.

Другие маркеры бластных клеток X:

1a — подобный антиген 80; Thy 1— антиген 3, "общий" антиген ОЛЛ 4,5; антиген Т10 25; LFA — 1 антиген 21; х-гаптен 14; CR 3 рецептор 29. Диагноз

Т-клеточного ОЛЛ устанавливают по наличию антигена Т10, определяемого монАТ 20, Экспрессия антигена, ныявляемого монАТ ИКО-44, на 367 бластных клеток указывает на то, что бластные клетки находятся на стадии дифференцировки. кортикальных тимоцитов, подвариант T-2 ОЛЛ.

Пример 2. В костном мозге боль- ного с лимфосаркомой содержится 1007 бластных клеток. На. 857 бластных клеток экспрессировал антиген, определяемый монАТ ИКО-44. Фенотип бластных клеток 7: 1a — подобный антиген

10; Thy — 1 антиген 2; LFA — 1антиген 7 5; х-гаптен 28; общий Т-клеточнбгй антиген 65; антиген хелперных индукторных клеток 19; поверхностные иммуноглобулипы 3,5. Диагноз Т-клеточНоН. IHMAocapKoM6l установлен llo наличию общего Т-клеточно" î антигена, выявляемого монАТ ЛГ 7. Экспрессия антигена, распознаваемого монАТ ИКО44, на 857. бластных клеток указывает на то, что бластные клетки находятся на стадии дифференциронки кортикальн61х тимоцитон. Диагноз — Т-2 подвариант -лимфосаркоми.

Таким образом, моноклональные антитела, полученные с помощью гибридом61, идентифицируют антиген кортикальных тимоцитон человека. NoIIAT

ИКΠ— 44 могут быть применены в жмунодиагностике льмфопролиферативных заболеваний. Экспрессия антигена кортикальных тимоцитов на бластных K$IPT ках позволяет выявить у больных с лимфопролиферативными заболеваниямибла с тн 6le кле тк и, н аходящие ся н а с тадин дифференцировки кортикальных тимоцитов. Выявление иммунологического

T-2 поднарианта лейкоза и лимфосаркомы необходимо для создания более эффективных llporpalm лечения больных.

Формула из обре тен ия

Штамм гибридных культивируемь|х клеток животных Mus musculus

ВСКК(П) Р 313Д вЂ” продуцент моноклональных антител к антигену кортикальных тимоцитов человека.