Способ культивирования тучных клеток

 

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, и может быть использовано для исследования процессов гемопоэза. Цель изобретения - повышение выхода клеток. К взвеси клеток - предшественников перед инкубацией вводят гепарин в дозе 40-100 ед/мл взвеси. Инкубацию смеси осуществляют в течение 10-14 дней в диффузионной камере, помещенной в брюшную полость лабораторного животного. При посадочной дозе 5 .10 5 кл/мл выход жизнеспособных тучных клеток составляет 2 .10 4 кл/мл (2 .10 3 кл/камеру).

(191 (!1) СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 С 12 И 5/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4465177/30-13 (22) 06.06.88 (46) 15.07.90. Бюл. Р 26 (71) Челябинский государственный медицинский институт (72) Г.К.Попов .и А.Г.Починский (53) 578.(f85.23 (088.8) (56) Nakano Т.et а1. Т,Ехр. Мед

vol. 162, р. 1025-1043, 1985. (54) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ТУЧНЫХ

КЛЕТОК (57) Изобретение относится к медициИзобретение относится к медицине, а именно к гематологии, и может быть использовано для исследования процессов гемопоэза.

Целью изобретения является повышение выхода клеток.

Способ иллюстрируется следующими примерами..

Пример 1. Культивирование тучных клеток иэ клеток-предшественников гемопоээа крысы.

Способ осуществляют на 1О крысах самцах популяции "Вистар" массой 160180 r, 20 мышах линии CBA массой 2540 r.

После дачи наркоза у крысы выделяют бедренную кость. Один конец кости скусывают,а другой протыкают толстой иглой по оси кости и вымывают костный мозг средой 199. После ресуспендирования через набор игл с уменьшающимся диаметром в 2 мл среды 199 взвесь центрифугируют при 400 g (1500 об/мин) в

2 не, а именно к гематологии, и может быть использовано для исследования процессов гемопоээа. Цель изобретения — повышение выхода клеток. К взвеси клеток-предшественников перед инкубацией вводят гепарин в дозе 40,100 ед/мп взвеси. Инкубацию смеси осуществляют в течение 10-14 дней в диффузионной камере, помещенной в брюшную полость лабораторного животного. При посадочной дозе 5-10 кл/мл выход жизнеспособных тучных клеток составляет 2 10 кл/мл (2 ° 1(Р кл/камеру). течение 10 мин. Затем надосадочную жидкость сливают, добавляют 2 мл среды 199 и манипуляцию повторяют.

Надосадочную жидкость убирают, добавляют 1,2 мл среды 199, ресуспендируют и фильтруют, пропуская через иглу с фильтром из четырех слоев капроновой сеточки. Полученный фильтрат наслаивают на градиент плотности фиколл-верографин (плотность р=1077 кг/л) и центрифугируют 8 мин при 400 g/

/1500 об/мин. Затем длинной иглой со шприцем отсасывают белесое облачко (" пуговица" — 1 мл, которое образуют мононуклеары на границе градиента плотности и взвеси клеток. Подсчет клеток-предшественников на жизнеспособность производят с использованием фазовоконтрастной микроскопии (объектив 20, окуляр 10) в камере Горяева.

Полученные клетки-предшественники иэ костного мозга крысы в стерильном боксе оставляют на адгеэию на 30 мин.

1578193

В шприц емкостью 1 мл .набирают

f>10 клеток (обычно это количество находится в 0 1-0,2 мл взвеси мононуклеаров),.добавляют к ним 40 ед, ген парика (на физрастворе) и доводят объем взвеси с гепарином до 1 мл плазмой животного. Вся манипуляция (получение взвеси клеток с гепарином) занимает 3, мин, а контакт клеток-пред-10 аественников с гепарином (до разведения плазмы) длится от одной до 3-х мин, Полученной взвесью (гепарин + клетКи) заполняют диффузионные микрокаме- ры путем прокола одного иэ торцов камеры. Место прокола промакивают сухой

Марлевой салфеткой и закреливают клеем Бф-б. Заклеенные камеры помещают в одноразовые чашки Петри, каждую камеру (по 5 камер в одну чашку) в каплю со средой 199.

После заполнения камеры имплантируют в брюхо мыши путем прокола иглой диаметром 3 мм. Камеры вводят через иглу — по 5 камер в одну мышь.

Через 14 сут культивирования камеры извлекают из брюшной полости животного. Один торец камеры срезают брйтвой и содержимое камеры выдавливают на предметное стекло, ведя каме" рой вдоль (по длине) стекла, чтобы мазок получился B виде дорожки. Мазки просушивают и фиксируют метанолом.

Окраску мазков производят по Романовскому-Гимэа, Паппенгейму, а с целью

Идентификации тучных клеток — толуидиновым синим.

Для контроля имплантируют камеры, Заполненные взвесью клеток с физраствором и беэ него.

Затем проводят морфологическую идентификацию колоний методом микроскопии»

Качественная характеристика колоний в контроле (контроль 1 с фиэраст- "5 вором и контроль 2 без него) — всего

20 камер - носит один и тот же характер и составляет: гранулоцетарные колонии 23,77, макрофагальные 45,8Х, "мешанные (гранулоцитарно-макрофагальные) 30,5%, Колоний .тучных клеток в мазках с контролем обнаружено не было.

В мазках с гепарином (всего 30 камер) 92Х составляют тучные клетки, .8Х макрофаги.

Пример 2. Культивирование тучных клеток из клеток-предшественников периферической крови человека

В центрифужную пробирку с 3 мл раствора Оловера добавляют 5 мл свежей цельной крови иэ локтевой вены человека; осторожно перемешивают стерильной стеклянной палочкой. Полученную смесь центрифугируют при

400 g (1500 об/мин.) в течение 30мин до тех nop„ пока смесь плазма-антикоагулянт не станет прозрачной. На границе "плазма-эритроциты" образовывается лейкопленка. Затем плазму отсасывают длинной иглой со шприцем, не доходя при этом 1-2 мл до лейкопленки, и помещают в стерильный бокс (для дальнейшего использования при приготовлении взвеси клеток).

Затем отсасывают лейкопленку, стараясь меньше захватить красной крови (объем — 1 мл}, и помещают ее (наслаивают) на градиент плотности фиколл-верографин (плотность р

1,077 кг/л). Длинной иглой со шприцем отсасывают белесое облачко (1 мл), образованное мононуклеарами на границе градиента плотности и взвеси клеток. Подсчет клеток-предшественников на жизнеспособность производят в камере Горяева фазовоконтрастной микроскопией.

Оставляют в течение 30 мин полученные клетки-предшественники в стерильном боксе.

В шприц (емкость 1 мл) набирают

1 10 клеток, добавляют к ним 100 ед гепарина (на физиологическом растворе), доводят объем взвеси с гепарином до 1 мл плазмой. Полученной вэвесью с гепарином + клетки заполняют диффузионные микрокамеры. Заклеенные микрокамеры помещают в чашки Петри со средой 199. Заполненные микрокамеры с помощью длинной иглы диаметром

3 мм имплантируют в брюшную полость мышей (по 5 камер в 1 животное), Всего имплантируют 20 камер с физраствором и беэ него (контроль 1 и 2) и 30 камер с гепарином. На 14 сут ки камеры извлекают иэ брюшной полости животных. Содержимое камеры вьщавливают. на предметное стекло, получая мазок в виде дорожки. Мазки просушивают и фиксируют метанолом. Окраску мазков производят по РамоновскомуГимза, Паппенгейму, толуоидиновым синим

Проводят морфологическую идентификацию колоний методом микроскопии, Составитель А.Маныкин

Редактор М.Недолуженко Техред N.яндык Корректор Т.Палий

Заказ 1892 Тираж 486 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101

5 15781

Качественная характеристика колоний в контроле (1 и 2) — всего 20 камер — носит один и тот же характер и составляет: грануилоцитарные 20, .! макрофагальные 53,3, смешанные 26,7Х.

В мазках с гепарином (всего 30 камер) 100 составляют тучные клетки, Использование предлагаемого способа позволяет повысить выход клеточной массы, улучшить пролиферативные свойства культивируемых клеток, а также упростить процесс культивирования. Способ перспективен при про93 6 ведении научных исследований на. тучных клетках.

Формула и э обретения

Способ культивирования тучных

-клеток, включающий получение взвеси клеток-предшественников с последующей их инкубацией, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения выхода клеток, перед инкубацией к взвеси клеток добавляют гепарин в дозе 40-100 Ед/мл, а инкубацию осуществляют в диффузионной камере, помещенной в брюшную полость животного.