Способ получения липида а из грам-отрицательных бактерий

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения биологически активных веществ из бактерий. Цель изобретения - упрощение технологического процесса и повышение выхода липида А при получении его из грам-отрицательных бактерий. С этой целью лиофильно высушенные бактериальные клети экстрагируют не менее трех раз по 4,5 ч 25-50-кратными объемами смеси хлороформ - метанол - 0,9-1,8-ная соляная кислота, взятых в объемном соотношении 10:(17-21):(7-12), объединенный экстракт разбавляют хлороформом и водой до установления в смеси равных объемов растворителей, нижнюю фазу образовавшейся двухфазной системы упаривают досуха, остаток хроматографируют на колонке со сфероном ОД-1000, колонку предварительно промывают ацетонитрилом и смесью ацетонитрила и изопропанола, взятых в объемном соотношении (4-5):1, после чего изопропанолом вымывают липид А, который перекристаллизовывают из ацетонитрила. При осуществлении способа из 1 г сухих клеток S.MINNESOTA R-595 получают 5-6 мг липида А, а из SH.FLEXNERI 2А - 1 - 2 мг липида А с содержанием основного вещества не менее 95%. Способ может быть осуществлен практически в любом масштабе и не требует сложной аппаратуры. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCH0IVIY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ НОМИТЕТ

110 ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ П.(НТ СССР

1 (21 ) 4471346/30-13 (22) 08.08,88 (46) 30.07.90. Бюл. У 28 (71) Научно-исследовательская лаборатория биологически активных веществ гидробионтов (72) К.Ю.Гордеев, В.Н.Филарин, С.Г,Батраков и А.В,Апполонии (53) 663.11:576.8.097(088.8) (56) ф гезМ N., Takayama К., Rishi Е, I. Biol. Chem, 1982, ч. 257, М, 19, р. 11808-11815. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПИДА А ИЗ

ГРАМ-ОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ (57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения биологически активных веществ из бактерий. Цель изобретения — упрощение технологического процесса и повышение выхода липида А при получении его из грамотрицательных бактерий. С этой целью лиофильно высушен-, ные бактериальные клетки экстрагируют не менее трех раз по 4,5 ч 2550-кратными объемами смеси хлороИзобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения биологически активных веществ из бактерий, а именно липида А.

Цель изобретения - упрощение тех-.:. нологического процесса и повышение выхода целевого продукта.

Способ основан на избирательном гидролизе биополимеров непосредственно в бактериальных клетках смесью хлороформ †метан — 0,9-1,8Х-ная соляная кислота 10:(17-21):(7-12).

„„ЯО„„1581718 А1 (51)5 С 07 Н 13/06 А 61 К 37/20

2 форм — метанол - 0,9-1,8Х-ная соляная кислота, взятых в объемном соотношении 10: (17-21 ): (7-12), объединенный экстракт разбавляют хлороформом и водой до установления в смеси равных объемов растворителей, нижнюю фазу образовавшейся двухфазной системы упаривают досуха, остаток хроматографируют на колонке со сфероном ОД-1000, колонку предварительно промывают ацетонитрилом и смесью ацетонитрила и изопроланола, взятых в объемном соотношении (4-5);1, после чего изопропанолом вьмывают липид А, который перекристаллизовывают из ацетонитрила. При осуществлении способа из 1 r сухих клеток

B. minnesota R-595 получают 5-6 мг липида А, а из Hh. flexneri 2А—

1 — 2 мг липида А с содержанием основного вещества не менее 957, Способ может быть осуществлен практически в любом масштабе и не требует сложной аппаратуры, 1 э,п . ф-лы, 2 табл.

Эта смесь обеспечивает удовлетворительную скорость гидролиза липополисахаридов при комнатной температуре, практически не расщепляет липид А и достаточно эффективно извлекает его из клеток. Кроме того, в укаэанных условиях обработки биоматериала происходит деструкция или необратимая модификация кислотостабильных компонентов клетки, вследствие чего в экстракт переходит значительно, меньше примесей, чем при извлечении

158 ) 718 нейтральными системами. рас творите-. лей.

Обработку биомассы проводят трехкратно, каждый раз не менее 4, 5 ч, используя 25-50-кратные объемы рас.т5 ворителей. При сокращении числа стадий экстракции. (табл. 1 ), продолжительности каждой стадии и объема экстрагента не достигается полное извлечение целев or о п родук та . Ув еличение объема смеси растворителей вызывает переход в экстракт больших количеств трудноотделимых примесей, в особенности мембранных фосфолипи= дов. Активному извлечению последних способствует также повышение содер жания хлороформа в экстрагенте, ка чество конечного продукта в этом случае снижается. Увеличение доли метанола или/и соляной кислоты в смеси растворителей приводит к: во-первых, к неполному извлечению липида А, во-в торых, к загрязнению экстракта нелипидными примесями. При использовании кислоты с концентрацией выше 1,8Х липид А заметно деградирует, а кислота с концентрацией менее 0,9_#_ не обеспечивает количественного гидролиза липополисахарида, вследствие чего выход целевого продукта падает.

Количество липида А в экстрактах в процессе его извлечения из клеток Salmonella minnesota 8-595 и

Shigella flexneri 2А по отношению к максимально извлекаемому количеству (по результатам 9 процессов выделения ) представлено в табл. 1 .

Для удаления водорастворимых веществ из экстракта к нему добавля = ют хлороформ и воду до достижения равных (+5X) объемов всех трех растворителей в смеси. В результате образуется двухфазная система, где липид А практически полностью находит, ся в нижней фазе, а гидрофильные примеси - в верхней. При увеличении количества хлороформа в смеси растворителей не обеспечивается максимальное освобождение от примесей. Уве5Î личение доли воды или/и метанола влечет потерю части целевого продукта с верхней фазой и снижает его выход.

На стадии основной очистки липида А применяют колоночную хроматографию с обращением фаз на сфероне

ОД 1000. В данной конкретной операции сферон имеет существенные преимущества по сравнению с сефадексом

ЬН-20, предложенным ранее для очист- ки липида А (Т), вследствие значительно большей его селективности и технологичности.

Вещества вносят в колонку в ацетонитриле. Этим же раствором вымывают полярные примеси, а для удаления менее полярных примесей используют смесь ацетонитрил — изопропанол (4-5):1. Увеличение дозы изопропанола в смеси растворителей приводит к частичному элюированию липида А вместе с примесями и снижению его выхода; при уменьшении содержания изопропанола полное удаление примесей не достигается. Окончательную очистку целевого продукта осуществляют путем его перекристаллизации из ацетонитрила, после чего продукт сушат в вакууме, Выход липида А при получении его из S. minnesota R-595 составляет 5-6 мг/г сухих клеток, а из

Sh. flexneri 2А-l 2 мг/г сухих клеток содержание основного вещества в обоих случаях не менее 957., Струк тура и сос тав полученных препаратов доказана методами ТСХ, ВЭЖХ, ГЖХ, ИК- и ПИР спектрами, Состав жирных к исло т и рив еде н в таб л. 2.

Способ иллюстрируется следующими примерами, Пример 1 . Суспензию 25 г лиофильно высушенных клеток S, minnesota R-595 в 625 мл (25-кратный объем ) рас тв ора хлороформ — метанол — 1,8Х-ная соляная кислота (1 0: 21: 7 ), перемешивают 4, 5 ч и филь труют через пористый стеклянный фильтр.

Цикл операций повторяют с отфильтрованными клетками еще 2 раза. Полученные фильтраты объединяют, добавляют 540 мл хлороформа и 690 мл воды (до объемного соотношения растворителей в смеси 1034:1036:1035), смесь встряхивают 5 раз и центрифугируют при 10000 g в теч ение 7 мин, Некиюю фазу отделяют и упаривают досуха (здесь и далее растворители отгоняют на роторном испарителе при

30 С и 20 мм рт.ст.). Остаток растс воряют в 30 мл ацетонитрила и раствор вносят в колонку, заполненную

200 r сферона ОД 1000. Колонку последовательно промывают 2500 мо ацетонитрила, 2000 мл смеси ацетонитрил — изопропанол (5:1 ), Элюент, по8)7)8

10!

5 лученный при промывании 1500 мл чистого изопропанола, упаривают досуха, остаток перекристаллизовывают из 15 мл ацетонитрила, сушат в вакууме (здесь и далее сушку проводят о при 25-30 С при О, 2 мм рт. ст. ) и получают 129 мг липида А (5,16 мг/г сухих клеток) в виде бисфосфата с содержанием основного вещества 96,4Х.

Пример 2. Суспензию 11 r лиофильно высушенных клеток S. minnesota R-595 в 550 мл (50-кратный объем) раствора хлороформ -метанол —, 0 9%-ная соляная кислота (10:17:12) перемешивают 5 ч и фильтруют через пористый фильтр. Цикл one раций пов торяют с отфильтрованными клетками еще

2 раза. Полученные фильтраты объединяют, добавляют 300 мл хлороформа и 210 мл воды, смесь встряхивают

5 раэ и центрифугируют при 10000 g в течение 7 мин. Нижнюю фазу отделяют и упаривают досуха. Остаток растворяют в 20 мл ацетонитрила и раствор вносят в колонку заполненную т

100 г сферона ОД 1000, Колонку последовательно промывают 1500 мл ацетонитрила, 1000 мл смеси ацетонитрил-изопропанол (4:1 ) . Элюент, полученный при промьвании 1000 мл чистого изопропанола, упаривают досуха, остаток перекристаллизовывают иэ

18 мл ацетонитрила, сушат в вакууме и получают 66, 4 мг лип ида А (6,04 мг/г . сухих клеток) в виде бисфосфата- с содержанием основного вешества 9/,9%.

П р име р 3, Суспенэию }3 r лиофильно высушенных клеток S. minnesota R-595 в 400 мл (31-кратный объем) раствора хлороформ — метанол — 1,5Х-ная соляная кислота (1 0:

:20:8) перемешивают 5 ч и фильтруют через пористый стеклянный фильтр.

Цикл операций повторяют с отфильтрованными клетками еще 2 раза. Полученные фильтраты объединяют, добавляют 320 мл хлороформа и 380 мл воды, смесь встряхивают 5 раз и центрифугируют при )0000 g в течение 7 мин, Нижнюю фазу отделяют и упаривают досуха. Остаток растворяют в 20 мл ацетонитрила и раствор вносят в колонку, заполненную )20 г сферона

ОД 1000. Колонку последовательно промьвают 1800 мл ацетонитрила и 1200 мл смеси ацетонитрил — изопропанол 4:1.

Элюент, полученный при промывании

) 200 мл чистОГО иэОпрО1! виола, %7117 рпвают досуха, Остаток перекристаллизоьывают из 25 мл ацетонитрил», сушат в вакууме и получают 77,9 мг липида А (5,99 мг/г сухих клеток) в виде бисфосфата с содержанием основного вещества 98, 2Х.

Пример 4. Суспензию 15 г лиофильно высушенных клеток Shigella

flexneri 2A в 375 мл (25-кратный избыток ) рас тв ора хлороформ — ме та-нол — 1,8Х-ная соляная кислота (10:

: 2l: 7 ) перемешивают 4, 5 ч и фильтруют через стеклянный пористый фильтр.

Цикл операций повторяют с отфильтрованными клетками еще 2 раза ° Полученные филь траты объединяют, добавляют 325 мл хлороформа и 415 мл воды. Смесь встряхивают 5 раэ и центрифугируют при 10000 g в течение

7 мин. Нижнюю фазу Отделяют и упаривают досуха ° Остаток растворяют в 10 мл ацетонитрила и раствор вносят в колонку, заполненную 100 r сферона ОД 1000. Колонку последовательно промывают 1800 мл ацетонитрила и ) 200 мл смеси ацетонитрила изопропанол (5:1 ), Эл1оент, полученный про промывании 1200 мл чистого изопропанола, упаривают досуха, остаток перекристаллизовывают из 5, 0 мл ацетонитрила, сушат в вакууме и получают 15,1 мг (1,01 мг/г сухих клеток) липида A в виде биофосфата с содержанием основного вещества 95,1Х.

Пример 5. Суспензию 10 r лиофильно высушенных клеток Sh. 1 1ехпег i 2А в 500 мл (50-к ра тный иэ быток ) раствора хлороформ — метанол

0,9Х-ная соляная кислота, взятых в объемном соотношении 1 0:17:2, перемешивают 5 ч и филь труют через стеклянный пористый филь тр. Цикл опе раций повторяют с Отфильтрованными клетками еще 2 ра за. Полученные фильтры объединяют, добавляют 270 мл хлороформа и 190 мл воды. Смесь встря.хивают 5 раэ, центрифугируют при

50.10000 g в течение 7 мин. Нижнюю фазу отделяют и упаривают досуха. Остаток растворяют в 10 мл ацетонитрила и . раствор вносят н колонку, заполненную 100 r сферона ОД 000. Колонку последовательно промьвают 1800 мл ацетонитрила и 1200 мл смеси ацетонитрил — изопропанол (4: 1 ) ° Элюент, полученный при промывании 1 200 мл чистого изопропанола, упариэают до1581 7 18

Таблица 1

Экстракт Количество липида А в экстракте, Х

S. ппрпезо1а

B-595

Sh. lexner i

2А

70-75

28-33

65-70

25-28

Менее

Следы

Не обнаружено

Следы

Не обнаружено

"óõà, остаток перекристаллизовывают из 5, О мл ацетонитрила и получают 19, мг липида A <1,9! мг/г сухих клеток) в виде бисфосфата с содержанием основного вещества 96,6Х. 5

Пример 6. Суспензию 11 г лиофильно высушенных клеток Sh. flexneri 2А в 340 мл (31-êðàòíûé избыток) раствора хлороформ — метанол—

1,5Х-ная соляная кислота (10;20:8) перемешивают 5 ч H фильтруют через

Пористый фильтр. Цикл операций повторяют с отфильтрованными клетками еще 2 раза. Полученные фильтраты 15 объединяют, добавляют 270 мл хлороформа и 320 мл воды. Смесь встряхивают 5 раз и центрифугируют при

10000 g в течение 7 мин. Нижнюю Фазу отделяют, упаривают досуха. Остаток 20 растворяют в 1 О мл anåòoíèòðèïà и вносят в колонку, заполненную 100 r сферона ОД 1000. Колонку последовательно промывают 1700 мл ацетонитрила и 1200 мл смеси ацетонитрил:изо- 25 пропанол (4: 1 ) . Элюент, полученный при промывании 1200 мл чистого изопропанола, упаривают досуха, остатск перекристаллиэовывают из 5,0 мл ацетонитрила и получают 21,8 мг липида

h. (1,98 мг/г сухих клеток) в виде бисфосфата с содержанием основного вещества 97„1%.

Формула изобретения

Способ получения липида А из

3 Г грам-отрицательных бактерий, включа-ющий лиофильную сушку бактериальных клеток, гидролиэ липополисахарица соляной кислотой, освобождение сыроrо продукта от водорастворимых примесей путем экстракции в двухфазной системе, образованной смесью хлороформа, метанола и воды, а также обращеннофазную хроматографию, о т л и— ч ающийс я тем, что, с целью упрощения технологического процесса и повышения выхода целевого продукта, клетки экстрагируют три раза по 4,5 ч

25-50-кратными объемами смеси хлороформ-метанол-О, 9-1,8Х-ная соляная кислота, взятых в объемном соотношении 10:(17-2!):(7-1 2), объединенный экстракт разбавляют хлороформом и водой до установления в смеси равных объемов растворителей, нижнюю фазу образовавшейся: двухфазной системы упаривают досуха, остаток хроматографируют на колонке со сфероном

ОД-1 000, колонку промывают ацетонитрилом и смесью ацетонитрила и изопропанола, взятых в объемном соотношении (4-5): 1 после чего изопропанолом вымывают липид A который перекристаллизовывают из ацетонитрила.

2. Способ по и. 1, о т л и ч а— ю шийся тем, что клетки грамотрицательных бактерий используют в или Б-форме.

158! 713

Та блица 2

Кислота""

S minnesota

R-595

Sh. flexneri

2А

15,8+3,0

18,6+2,6

«» Подстрочный индекс — количество атомов углерода в кислоте: количество двойных связей.

Составитель Г. Осипов

Техред М. Ходанич Ко ррек то р Э. Лончак ова

Редак тор М. Недолуженко

Заказ 2066 Тираж 306 Под п ис ное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

М

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101

ft l0

Си:о

2 ОН-С„.

f6:<

Ц;I

С 1

Неиде нтифицированные жирные кислоты

9,4+0,3

1380,5

14,2+0,5

4,1+ 0,2

30,8+1,1

11,910,4

9,0+0,3

15,1 0,5

22,6 0,7

8,4 0,3

19,6+0,6

6,7+0,2