Способ получения трет-бутилоксикарбонил-лейцин-энкефалина
Изобретение относится к биоорганической химии, а именно к ферментативному синтезу пептидов, и может быть использовано для получения пептидов заданной последовательности. Цель изобретения - ускорение и упрощение получения целевого продукта. Способ получения трет-бутилоксикарбонил-лейцин-энкефалина заключается в синтезе этого пептида из гликолилглицилового эфира трет-бутилоксикарбонилтирозилглицина (N-защищенный аминокомпонент) и глицилфенилаланиллейцина (аминокомпонент) путем пропускания водной смеси этих соединений через колонку с иммобилизованным на кремнеземе папаином с последующим выделением из раствора полученного пентапептида. Способ позволяет ускорить процесс (в 140 раз) и упростить его. 1 табл.
СОЮЗ COBETCHHX
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (l9) (!1!
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Н А ВТОРСИОЬЮ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
flO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И OTHPbff ÈßÌ
ПРИ ГКНТ СССР (21) 4449327/3?-13 (22) 27.06.88 (46) 30.08.90. Бюл. 30 (71) Институт химии поверхности
АН УССР (72) С.A.Огий, 10.B.Митин, В.А.Тертых и В.В.Янишпольский (53) 577.15(088.8) (56) Khmelnitsky Yu. L. et al.
Optimization of enryme catalyzed
peptido synthesis in à "Water-water
immiscible" organic solvent byphas ic system. — Te trahedron. 1984, vol. 40, ¹ 2?, р. 4425-4432.
Chi — Hueg Wong et al. Enzyme
synthesis of opioid peptides. - Biochem. et Boiphys. Acta. 1979, vol. 576, № I, р. 247-249, (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРЕТ-БУТИЛОКСИКАРБОНИЛ-ЛЕЙЦИН-ЭНКЕФАЛИНА
Изобретение относится к биоорганической химии, а именно к ферментативному синтезу пептидов, и может быть использовано в практике синтеза пептидов заданной последовательности или конденсации пептидных фрагментов, в том числе для получения биологически активных пептидов.
Цель изобретения — ускорение и упрощение процесса получения целевого продукта.
Способ заключается в использовании для синтеза лейцин-энкефалииа гликолилглицинового эфира трет-бутнлоксикарбонилтирозилглицина (Вос
Туг 01у OCH Цель изобретения — ускорение и упрощение получения целевого продукта, Способ получения трет-бутилоксикарбонил-лейцин-энкефалина заключается в синтезе этого пептида из гликолилглииилсвого эфира трет-бутилоксикарбонилтироэилглицина (N-защищенный аминокомпонент) и глицилфенилаланиллейцина (аминокомпонент) путем tlpoпускания водной смеси этих соединение через колонку с иммобилизованным на кремнеземе папаином с последующим выделением из раствора полученного пентапептида, Способ позволяет ускорить процесс (в 140 раз) и упростить его. 1 табл. И-защищенного карбоксильногo компонента и глицилфенилаланиллейцина ,(HGly Phe Leu ОН) в качестве аминного компонента. Оба компонента растворяют в водном буферном растворе, а затем пропускают через колонку с иммобилизованным на кремнеземе папаине, При пропускании раствора двух пептидных компонентов через иммебилизоваиный папаин между ними образуется пептндная связь и конечный продукт выделяется обычными способами из пропущенного через колонку раствора. Использование гликолипглициновых эфиров позволяет проводить реакцию в водных растворах, а также ускорить процесс. 1585332 Ускорение и упрощение процесса достигается также эа счет применения нммобилизованного папаина, через который пропускается в проточном режиме смесь исходных компонентов. Применение предлагаемого способа позволяет значительно ускорить процесс (5-1 0 мин вместо- 24 ч). Упрощение процесса достигается заменой 10 водно-органических растворов на водные, понижением температуры до комнатной, а также возникновением возможности многократного. исполь зования иммобилизованного фермента и простотой отделения этого катализатора от реакционной смеси. Пример 1. Используется проточный реактор объемом 1,2 rM, содержащий 400 мг иммобилизованного íà 20 органокремнеземе папаина. Исходные компоненты растворяют в I M Na-карбонатном буфере (РН 9,5). Проточный реактор с иммобилизованным папаином ,промывают буфером, после чего через 25 колонку пропускают раствор, содержащий исходные компоненты синтеза (BocTyr С1УОСН СО С1УОН, H ly P»e Leu ОН) . Объем пропускаемого раствора 5 мл, содержание компонентов по 0,5 ммоль. Скорость прокачивания растворенных субстратов выбирается так, что карбоксильный компонент полностью гидролиэуется иммобилиэованным феРментом за время пРотекания Раство- 35 ра через проточный реактор, составляет 1 мл/мин. Раствор, содержащий конечные продукты, собирают на выходе проточного реактора и выделяют синтезированный пентапептид следующим образом. К собранному на выходе раствору добавляют 10Х-ный водный раствод КНЯО и экстрагируют пентапептид в этилацетат. Органический слой отделяют от водного и упаривают. Очистку ко- 45 нечного продукта осуществляют на колонке с силикагелем в системе толуол — диоксан - гексан — трифторэтанол — уксусная кислота, 50:40,. 15: :5:1(А). Полученный продукт выдерживают несколько. часов в вакууме над К0Н. Чистоту продукта проверяют с использованием тонкослойной хроматографии в системе (А), сравнивая с химически синтезированным Вос-Leu-энкифалином. На хроматограммах по55 бочные пятна отсутствуют, подвиж-ность пентапептида в системе (А) составляет Rf 0,13. Аминокислотный анализ конечного продукта показал идентичность аминокислотного сос" тав а Leu- э нк ефалину. Выход В ос-Leu-энкефалином составляет 53Х, время синтеза 5-10 мин, температура 20 С. Пример 2. Синтез проводят в тех же условиях, что и в примере 1, с тем лишь отличием, что содержание компонентов, ммоль карбоксильный 0,5, аминокомпонент 1,5. Скорость прокачивания раствора компонента 0,85 мл/мин, Выход конечного продукта 72Х, Использование избытка .одного из компонентов ведет к увеличению выхода. Увеличение скорости прокачивания карбоксильного и аминокомпонентов через проточный реактор ведет к значительному количеству непрореагировавшего карбоксильного компонента. Уменьшение скорости прокачивания ведет к уменьшению выхода конечного продукта. Конкретные значения концентраций. компонентов и скорость пропускания через колонку не имеют существенного значения потому, что при любых реально возможных концентрациях исходных компонентов достигается положительный эффект, а скорость пропускания раствора через колонку зависит от геометрических размеров колонки и массы демобилизованного фермента. В таблице приведена сравнительная характеристика условий синтеза и выхода соединений, полученных по предлагаемому и известному способам. Таким образом, из данных таблицы видно, что способ обеспечивает ускорение и упрощение процесса. Несмотря на то, что выход конечного продукта приблизительно одинаков, предлагаемой способ выгодно отличается от известного: существенно сокращается время синтеза (в 140 раз), реакция протекает при комнатной температуре в водной среде, Использование иммобилизованного фермента дает возможность работать с ним многократно и в непрерывном режиме. Формула изобретения Способ получения трет-бутилоксикарбонил — лейцин-энкефалина, включающий растворение И-защищенного карбоксильного и аминного пептидных компонентов в растворителе, инкубацию смеСпособ Конечный продукт Условия синтеза й., С Раствоо ритель Время синтеза Фермент Выход, 7. BocTyrGlyGlyPheLeu ON 5-) 0 мин 20 Водный Иммоби- До 70 раствор лизованный Предлагаемый папаин Водно- Раство- 66 органи- римый ческая фермент Иэвест- BocT7r(Brl)Gly PheLeu 24 ч 2 ный ОТИВ 37 смесь Составитель В. Муронец Техред Л. Сердюкова Корректор Q, щевкун Редактор Н. Киштулинец Заказ 2304 Тираа 48) Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Иосква, Ж-35 ° Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", r.уагород, ул. Гагарина,101 5 1585332 6 си в присутствии папаина для обра- глициновый эфир трет-бутилоксикарбоэования пептидной связи и последую- нилтирозилглицина, в качестве аминщее выделение целевого продукта, ного компонента — глицилфенилаланилотличающийся тем, что, лейцин, растворение ведут в водном с целью ускорения и упрощения процес- буферном растворе, а инкубацжо с паса получения целевого продукта, в панком проводят путем пропускания качестве N-защищенного карбоксильно- смеси через колонку с иммобилизованго компонента используют гликолил- ным на кремнеземе папаином.
