Способ получения ферментсодержащих пленок для определения моноаминов

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению ферментсодержащих препаратов для химического, клинического и токсикологического анализа. Цель изобретения - улучшение качества ферментсодержащих пленок за счет повышения избирательности анализа моноаминов и увеличение срока годности пленок. Способ заключается в получении желатиновых пленок, содержащих моноаминоксидазу и обработанных глутаровым альдегидом, и инкубации полученных пленок в течение 40-50 мин раствором ингибитора-профлавина в концентрации 5<SP POS="POST">.</SP>10<SP POS="POST">-4</SP>-8<SP POS="POST">.</SP>10<SP POS="POST">-3</SP>-1,5<SP POS="POST">.</SP>10<SP POS="POST">-3</SP> М. Пленки могут быть использованы для совместного и раздельного определения разных моноаминов в биологических жидкостях. У пленок в 3 раза увеличивается срок годности, предел обнаружения моноаминов 10<SP POS="POST">-9</SP> М. 1 табл.

C0IO3 СОВЕТСНИХ

И Ф

РЕСПУБЛИН

{51) 5 С 12 N 11/10, 9/06

I г

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н Д ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ г

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР! (21) 4319058/28-!3 (22) 20.10.87 (46) 15.05.90. Бюл, ¹ 18 (71) Научно-производственное обьединение "Биолар" и Латвийский государственный университет им. П; Стучки (72) Д,Ю. Балцере, Б.А. Гринберг, А.А. Прикулис, Е.Б. Никольская, О..В. Ягодина и Г.К. Микелсоне

:(53) 577,15 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР № 1495378, кл. С 12 N 11/12, 27.07.87, Durand P. et а1. An enzyme electrode for acetylcholine. — Biophys., Biochim Acta,, )978, 527, р. 277-281. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТСОДЕРЖАЩИХ ПЛЕНОК ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОНОАМИНОВ (57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению ферИзобретение относится к биотехнологии, в частности к получению ферментсодержащих препаратов для химического, клинического и токсикологического анализа.

Целью изобретения является улучшение качества ферментсодержащих пленок за счет повышения избирательности анализа моноаминов и увеличения срока годности пленок.

Способ заключается во введении препарата моноаминоксидазы в буфер-.„ ный раствор желатина, нанесении полу ченного раствора на подложку, высушивание раствора на воздухе для получения пленки и ее обработки глутаровым альдегидом с последующей инку„.SU,„, 1564187 А1

2 ментсодержащих препаратов .для химического, клинического и токсикологического анализа. Цель изобретения— улучшение качества ферментсодержащих пленок за счет повышения избирательности анализа моноаминов и увеличение срока годности пленок. Способ заключается в получении желатиновых пленок, содержащих моноаминоксидазу и обработанных глутаровым альдегидом, и инкубации полученных пленок в течение

40 — 50 мин раствором ингибитора-профлавина в концентрации 5 -10 4 — 8 х к10-41! или ! 0- - 1,5 О g. Пленки

l могут быть использованы для совместного и раздельного определения разных моноаминов в биологических жидкостях. У пленок в 3 раза увеличивается срок годности, предел обнаружения моноаминов 10 з М. 1 табл. бацией пленки в течение 40-50 мин в растворе ингибитора-профлавина в концентрации 5 10 ... 8 -!О М или 1 10 .. ° 1,5 10 М.

При обработке профлавином в концентрации 5 .1 О ...8 1 О М ингибируется активность моноаминоксидазы.В, катализирующую дезаминирование бензиламина. Такая пленка пригодна для избирательного определения тирамина .и серотонина, При концентрации проф лавина 1 ° 10 ° ..1,5-10 М ингибирует— ся моноаминоксидаза, дезаминирующая тирамин. Полученный препарат пригоден для определения серотонина.Совместное или раздельное использование ферментсодержащих пленок позволяет

1564187 более избирательно определять моноамины в биологических жидкостях. Срок годности пленок возрастает в 3 раза.

Пример 1. 0,5 т желатина помещают в стаканчик с 10 мл дистилли5 рованной воды для набухания. Затем туда же добавляют 1 0 мл О, 05 М фосфатного буфера, рН 7,4„ и нагревают

При переметивании до полного растворения желатина. Далее раствор охлажо дают до +25 С и вносят в него 2 r гомогената митохондрий печени свиньи или О, 01 г лиофилизированной моноаминоксидазы в 1 мл 0,05 M фосфатном буфере, рН 7,4, перемешивают ° Смесь порциями по 5 мл выливают на ровную поверхность полиэтиленовой пластинки и высушивают в потоке воздуха в течение 1,5 ч. Сухую пленку желатина с включенной в ней моноаминоксидазой обрабатывают 10 мл 47.-ного раствора глутарового альдегида (ГА) в течение

3-5 мин. После этого избыток раствора ГА сливают, а пленку многократно 25 промывают водой и 0,05 M фосфатньж буфером, рН 7,4 и снова высушивают в потоке воздуха в течение 1 ч (образец 1) . Далее одну сухую пленку обрабатывают 10 мл 7,6 10 моль/л раст- 30 вором профлавина в течение 45 мин, После обработки профлавином пленку высушивают в .потоке воздуха при

+15 С (образец 2).

Третью пленку, высушенную после обработки глутаровым альдегидом, обрабатывают 10 мл 1,3 10 моль/л раствором профлавина в течение 45 мин.

После обработки профлавином пленку о высушивают в потоке воздуха при 15 С 40 (образец 3) °

Ферментсодержащие пленки хранят в холодильнике при 4-10 С.

Результаты опытов приведены в таб лице. Все пленки получают аналогично ,примеру 1 за исключением концентрации ингибитора и продолжительности обработки, которые указаны в таблице.

Проверка полученных ферментсодержащих пленок проведена согласно приведенной методике.

Определение моноаминов в биологической жидкости.

Ферментсодержащий препарат — пленку с MAO активностью (образец 1)

55 помещают в сосуд для измерений электрода с газовым зазором, добавляют туда же 3, 5 мл О, 15 моль/л раствора

КС1 или NaC1 и 0,5 мл исследуемой крови человека .. Измерительньй сосуд закрывают, помещают в термостат при о

35 С, включают магнитную мешалку и

10 мин пропускают 0 без СО, . Далее поток 0 перекрывают и герметически закрытый сосуд выдерживают„30 мин при

35 С с интенсивным перемешиванием.

После инкубации ферментсодержащую пленку вынимают, в сосуд добавляют

1,4 r КС1, охлаждают сосуд до 25 С, закрывают пробкой с рН стеклянным электродом, на поверхность которого помещена капля 0,27-ного раствора тритона Х- 305 (ПАВ) в бидистиллированной воде, снова пропускают 0 без

СОп и затем через капилляр вводят в реакционную смесь 0,2 мл 1 моль/л

Na0H (рН раствора 12) для полного освобождения NH, После установления постоянного потенциала (рН)(20 мин) на электроде записывают показания потенциометра (рН-метра). Находят по градуировочной прямой значение концентрации общих моноаминов (МА), соответствующее значению потенциала.

Для контроля содержания аммония в крови (фоновое содержание NH ) проводят описанный опыт только в реакционной смеси, вместо ферментсодержащей пленки с МАО активностью помещают контрольную желатиновую пленку без фермента.

Общее содержание моноаминов в кро-: ви рассчитывают как разность между общим количеством аммиака минус фоновое количество аммиака. Оно составляет 0,33 мкг/мл крови., Содержание тирамина и серотонина в модельной смеси.

Ферментсодержащий препарат — пленку с МАО активностью, обработанную профлавином с концентрацией б "

«10 моль/л (образец 2) помещают в сосуд для измерений электрода с газовым

-G зазором, pîáàâëÿ îò 0,32 мл 5 10 моль/л раствора серотонина, 0,24 мл 5 «

«10 моль/л раствора тирамина и

0,24 мл 5 10 моль/л раствора бензиламина. Туда же добавляют 3,2 мл Кфосфатного буфера, рН 7,6. Таким образом, концентрация в реакционной смеси: серотонина 4 .10 моль/л, тирамина — 3 10 моль/л, бензинамина—

3 10 моль/л.

Общая концентрация моноаминов в реакционной смеси 1 ° 10 моль/л, Измерительный сосуд закрывают., помещают в термостат при - 5 C, включа4187 d

45 После установления постоянного потенциала (рН) на электроде записывают показания рН-метра.

50 рамина и серотонина 0,26 мкг/мл крови, соответствующее значению потен,;желатиковую пленку с МАО активностью . обработанную профлавином с концент° рацией 8 ° 10" моль/л в течение 50 мин.

5 156 ют магнитную мешалку и 10 мин пропускают О беэ СО>. Далее поток О перекрывают и герметически закрытый сосуд выдерживают 50 мин при 45 С и интенсивном перемешивании. Далее проводят все операции аналогично примеру 1.

Находят по градуировочной прямой значение концентрации суммы серотонина и тирамина, т.е. 7 -10 7моль/л, соответствующее значению потенциала.

Определение серотонина в модельной смеси.

Ферментсодержащий-препарат — пленку с МА0 активностью, обработанную фосфатным буферным раствором профлавина с концентрацией ингибитора 1,3"

° 10 моль/л в течение 45 мин (обра-3 эец 8), помещают в сосуд для измерений электрода с газовым зазором, добавляют туда 0,32 мл 5 «

«10 моль/л раствора серотонина, О,?4 мл 5 ° 10 моль/л раствора тирами-1 на и 0,24 мл 5.10- моль/л раствора бензиламина. Туда же добавляют 3,2 мл

К-фосфатного буфера, рН 7,6. Концентрация в реакционной среде, моль/л:

-7 7 ° серотоник 4 10;тирамин 3 -10; бензиламин 3 10

Общая концентрация моноаминов в

-1 реакционной смеси 1 10 моль/л.

Измерительный сосуд закрывают, поо мещают в термостат при 45 С, включают магнитную мешалку и 10 мин пропускают О g без CO a.

Затем поток О перекрывают и герметически закрытый сосуд выдерживао ют 50 мин при 45 С и интенсивном перемешивании. Далее проводят аналогично примеру 1.

Находят по градуировочной прямой значение концентрации серотонина 3»

«10 моль/л, соответствующее значению потенциала.

Пример 2, Определение суммарного количества тирамина и серотони- на.

0,5 г келатина помещают в стаканчике с 10 мп дистиллированной воды для набухания. Затем туда же добавляют 1О мл 0,05 М фосфатного буфера, рН 7,4, и нагревают при перемешивании до полного растворения желатина.

Далее раствор охлаждают до +25 С и вносят в него 2 г гомогената.митохондрий печени свиньи в 1 мл 0,05 М фосфатном буфере, рН 7,4, перемешивают. Смесь выливают на ровную по t0

40 верхность и высушивают в потоке воздуха в течение 1,5 ч. Сухую пленку желатина с включенной в кей МАО обрабатывают 10 мл 4Х-ного раствора глу тарового альдегида в течение 5 мин, После этого избыток раствора альдегида сливают, а . пленку многократно промывают водой и 0,05 М фосфатным буфером» рН 7,4, и снова высушивают в потоке воздуха в течение 1 ч.

Сухую желатиковую пленку с МАО активностью обрабатывают 10 мп раствора профлавина с концентрацией

5 10 моль/л в течение 40 мик. После обработки избыток раствора сливают, пленку промывают фосфатным буфером и высушивают в потоке воздуха.

Пленка пригодна для определения суммарного количества тирамина и серотонина в биологических жидкостях.

Пленку помещают в сосуд для измерений электрода с газовым зазором, добавляют 3,5 мл 0,15 моль/л раство« ра КС1 и 0,5 мл исследуемой крови человека.

Измерительный сосуд закрывают, помещают в термостат при 40 С, включают магнитную мешалку и 10 мин пропускают О 7 без СО7. Далее поток перекрывают и герметически закрытый соCO суд выдерживают 50 мин,при 40 С с интенсивным перемешиванием. После инкубации ферментсодержащую пленку вынимают, в сосуд добавляют 1,4 r

КС1, охлаждают сосуд до 25 С, закрывают пробкой с рН стеклякным электродом, ка поверхность которого помещена капля 0»2Х-ного раствора тритона Х-305 в бидистиллированной воде, снова пропускают 0< без СО и затем через капилляр вводят в реакционную смесь 0,2 мл 1 моль/л NaOH (рН 3 12). для полного освобождения аммиака.

По градуировочной прямой находят значение суммарной концентрации тициала.

Пример 3. Определение содержания тирамина и серотонина в крови ведут аналогично примеру 2, однако применяют ферментсодержащий препарат-- !

564187

По градуировочной прямой:находят суммарную концентрацию тирамина и серотонина 0,27 мкг/ил крови.

Пример 4. Получают желатиновую пленку с ИАО активноотью согласно примеру 2. Сухую пленку обрабатывают 10 мл фосфатного буферного раствора профлавина с концентрацией 4

«1О моль/л в течение 35 мин.

После обработки высушенную пленку проверяют для определения тирамина и серотонина в крови.

Инкубирование и определение аналогично примеру 2. Объем исследуемой крови также 0,5 мл. По градуировочной прямой находят значение концентрации моноаминов 0,30 мкг/мл, соответствующее значению потенциала.

В данном случае результат завышен из-за недостаточного ингибирования активных центров MAO ответственных за деэаминирование бензиламина и, следовательно, .определяется еще и

25 часть бензиламина.

Пример 6. Ферментсодержащий препарат — желатиновую пленку с ИАО активностью, обработанную профлавином с концентрацией 1,3 10- моль/л в течение 40 мин, помещают в сосуд для измерений электрода с газовым, зазором, добавляют 3,5 мл 0,15 мл/л раствора КС1 и 0 5 мл исследуемой крови человека.

Далее проводят все операции аналогично примеру 2.

55

Пример 5. В сосуд для измерений электрода с газовым зазором помещают ферментсодержащий препарат— желатиновую пленку с МАО активностью, 30 обработанную профлавином с концентрацией 9,5 .10 "моль/л. Добавляют 3,5 мл

0,15 моль/л раствора КС1 и 0,5 исследуемой крови, Инкубирование и оп-! ределение аналогично примеру 2.

По градуировочной прямой находят значение суммарной концентрации моноаминов 0 24 мкг/мл . В данном случае результат занижен, поскольку завышенная концентрация ингибитора час- 40 тично ингибировала уже активные центры ИАО, ответственные за дезаминирЬвание тирамина и, следовательно, определяется.все количество серотонина и только часть тиранина. Препа- 45 рат не пригоден для суммарного опре-, деления тирамина и серотонина.

Находят по градуировочной прямой значение концентрации серотонина . 0,15 мкг/мл.

Пример 7. Определение ведут аналогично примеру 2 с использованием желатиновой пленки, обработанной профлавином с концентрацией !,5

"10 моль/л.

Находят концентрацию серотонина

0,15 мкг/мл.

Пример 8. Определение ведут аналогично примеру 2 с использованием желатиновой пленки, обработанной . профлавином с концентрацией 1,4 « х10 моль/л в течение 50 мин.

Найденная концентрация серотонина 1,15 мкг/мл.

Пример 9. Ферментсодержащий препарат — пленку с МАО активностью, обработанную профлавином с концентрацией 9,0 10 " моль/л в течение

60 мин, помещают в сосуд. Добавлявт 3,5 мл 0,15 моль/л раствора КС1 и 0 5 мл исследуемой крови. Далее инкубирование и определение аналогично примеру 2, По градуировочной кривой находят значение концентрации моноамина

0,17 мкг/мл. В данном случае результат концентрации серотонина завы— шен, поскольку концентрация ингибитора профлавина была недостаточной для полного ингибирования активных центров МАО, дезаминирующих тирамин, и, следовательно, вместе с серотонином определяется еще часть тиранина, Пример 10.. Ферментсодержащий препарат — пленку с MAO активностью, обработанную профлавином с концентрацией 1,6 ° 10 моль/л в течение

45 мин, помещают в сосуд, Добавляют

3,5 мл 0,15 моль/л раствора КС1 и

0,5 исследуемой крови. Далее инкубирование и определение аналогично примеру 2.

По градуировочной кривой нахоцят значение концентрации моноамина

; 0,15 мкг/мл. Так же как в примерах 6. 8 определяется все количество серотонина. Следовательно, оптимальным препаратом для определения серотонина является пленка, обработанная препаратом профлавином с концентрацией

1 10 з- 1,5 .10 моль/л. Применение препарата, обработанного увеличенным количеством ингибитора, не требуется и является нецелесообраэным.

Ь )

Найденные в анализируемой смеси ма-. ноамины

Образецец

Введенные в анализируемую смесь моноамины, моль/л

Продолжит ельОбработка профлавином с концентрацией, моль/л ность обработки, мин

Тира- Серота- Бенэил- Суммарн, мин нин амин колич моль/л Состав

Беэ обработки профлавином

3 10 4")0

1 10 (Сумма рное с количество

3 !О

1 10 тирамэна, сератонина и бенэиламина

7,00 "10 7 Суммарное количество

3 )О

3 10 4 10 з

1 ° 10 >

6 10 4 тирамина и серотонина

6,95.10 Суммарное количество

1 10

3 )0 4 )0 7 3 )0

8 10-4

3, )О- 4>)0-

3 10-ч 4;)0 7 тирамина и сератонина

6,97 !О "

8>5 .10 7 Суммарное количество

3 10

3") 0

5 10

35 тирамина и серотонина, часть бенэиламина

5,8 10 (Общее количество серо.

3 10 4 10 )6 9 104

60 танина и

9 1564 I 8

Желатиновые пленки, обработанные профлавином, пригодны для многократного использования, поскольку профлавин является необратимым ингибитором MAO и в условиях использования пленок профлавин не вымывается в течение всего срока пригодности, кото-. рый лимитируется механической сохранностью пленки. Срок годности плен- 10 ки 4 мес (при проведении 5 определений ежедневно), В сухом виде при о

4-10 С - ферментативная активность пленки сохраняется в течение 9 мес.

Таким образом, предложенный способ позволяет получить ферментсодержащие пленки, пригодные для определения моноаминов, с улучшенными характеристиками, а именно с увеличен= 20 ными избирательностью и сроками годности. В 3 раза увеличивается срок годности и возникает возмо;кность совместного и раздельного определения моноаминов в биологических жидкостях 25 без введенияв системудля определения

7 )O дополнительных количес". =. \н)ибитсрог моноаминоксидаз. Лрепар.>т обеспечивает предел обнаруже)п(я моноаминов до 10 М.

Формула изобретения

Способ получения ферментсодержащих пленок для определения моноаминов, включающий введение препарата моноаминоксидазы в буферный раствор желатина, нанесение полученного раствора на подложку, высушивание раствора на воздухе для получения пленки и последующую обработку поверхности пленки глутаровым альдегидом, о т— л и ч а ю шийся тем, что„ с целью улучшения качества ферментсодержащих пленок .за счет повышения избирательности анализа моноаминов и увеличение срока годности пленок, полученную пленку обрабатывают в течение 40-50 мин раствором ингибиторапрофлавина в концентрации 5 10 4...

8 IO 4 М или 1 !О ...1,5-)0 )).

12

Продолжение таблицы

1564187

Введенные в анализируемую смесь моноамины„ моль/л

Обра зец родолжительБензил- Суммарн; амин колич.

Тира- Сер отв мин нин

I моль/л Состав

7 1 ° 10 9 40

3 107 4 :. 3 10

8 1 3.10-з 45

9 1,5 10 50

10 1,7«10 60

Составитель В. Муромец

Редактор Т. Лазоренко Техред Л.Олийнык

Корректор M. Самборская

Заказ 1139 Тираж 484 Подписное

BHHHIIH Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж 35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Ужгород, ул. Гагарина, 101 бработка профлавиом с конентранией оль/л ность обработ ки, мин

3 101

310>

4 1О"

4 10

4 0-1

3 10

3 10

3 ° 10

1 ° 10

l O-c

1 il0 4

Найденные в анализируемой смеси моноамины

1 часть тирамнна . т

3,98.10 Только серотоннн

3,99 10 1

4,0 ° 10 1

3,99 ° 10

1,

Способ получения ферментсодержащих пленок для определения моноаминов Способ получения ферментсодержащих пленок для определения моноаминов Способ получения ферментсодержащих пленок для определения моноаминов Способ получения ферментсодержащих пленок для определения моноаминов Способ получения ферментсодержащих пленок для определения моноаминов Способ получения ферментсодержащих пленок для определения моноаминов 

 

Похожие патенты:

Изобретение относится к способу получения амидов с помощью микроорганизмов, более конкретно к способу гидратации нитрилов под действием микроорганизмов, в результате чего получают соответствующие амиды

Изобретение относится к препаративной энзимологии и касается выделения высокоочищенного фермента и может быть использовано в медицине и науч-

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к технологии получения ферментных препаратов

Изобретение относится к макроинкапсулированию секреторных клеток в гидрофильном геле, к терапевтическим методам, в которых используются макроинкапсулированные секреторные клетки, и к сохранению секреторных клеток путем макроинкапсулирования

Изобретение относится к биотехнологии, а именно, к способам получения диагностических препаратов и может быть использовано в медицине

Изобретение относится к биотехнологии , в частности к способам кислотопонижения виноматериалов, и может найти применение для производства вин

Изобретение относится к сорбентам для аффинной хроматографии и позволяет повысить селективность разделения нуклеиновых кислот

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению ферментсодержащих препаратов для химического, клинического и токсикологического анализа

Наверх