Способ стабилизации протеазы bacillus suвтilis

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии получения нерастворимых ферментных комплексов, и может быть использовано в микробиологической промышленности, медицине и ветеринарии. Цель изобретения - увеличение стабильности препаратов иммобилизованной протеазы при хранении. Способ заключается в том, что препарат протеазы из BAC.SUBTILIS-65, иммобилизованной на активированной 2,4,6-трихлор-1,3,5-симтриазином целлюлозной матрице, промывают 0,1-1,0 М водным раствором солей органических кислот общей формулы R-(COOM)<SB POS="POST">N</SB>, где R - остаток, содержащий 1-4 углеродных атомов

М - щелочной или щелочно-земельный металл

N=1 или 2 (например, ацетаты натрия, кальция или магния, пропионат натрия, валерат натрия, глутаминат натрия, сукцинат натрия и др.). Промывку повторяют до исчезновения белка в промывных водах. Препарат хранить при 4-6°С в виде 10-30%-ной суспензии. После хранения в течение 24 мес сохраняется 45-80% активности. 1 з.п.ф-лы, 2 табл.

СОЮЗ COBETCHÈÕ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4451735/30-13 (22) 29.06.88 (46) 07.10.90. Бюл. Р 37 (71) Научно-производственное объединение "Фермент" (72) Г.И.Денис, Ю.IO.Степонавичюс, P.Â.ÏÿòHþíac, И.И.Кюдулас, А.-С.А.Глемжа, Д.Й.Вайткене, Д.И.-Г.Залецките и P.A.Êâàíäÿðàñ (53) 663.18(088.8) (56) Чуенко А.B., Давиденко Т.И., Потапский0.П. и,цр, Иммобилизация про.— теолитических ферментов на перевязочных средствах. — Докл. АН УССР, сер. Б, Геол., хим. и биол. науки, 1986, Р 1, с. 81-84.

Авторское свидетельство СССР

Р 1161552, кл. С 12 N ii/00, 1983. (54) СПОСОБ СТАБИЛИЗАЦИИ ПРОТЕАЗЫ

BACILLUS SUBTILIS (57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии получения нерастворимых ферментных комплексов, и может быть использовано

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии получения нерастворимых ферментных комплексов, и может быть использовано в микробиологической промышленности, медицине и ветеринарии.

Цель изобретения — увеличение ста бильности препаратовиммобилизованной протеазы при хранении.

Препарат протеазы из Bacillus subtilis, иммобилизованной на активированной 2,4,б-трихлор-2,3,5-сим-триазином (ТТ) целлюлозной матрице, про(19>SU (ll) (gg)5 С 12 N 11/00, 9/96

2 l в микробиологической промышленности, медицине и ветеринарии. Цель изобретения — увеличение стабильности препаратов иммобилизованной протеазы при хранении. Способ заключается в том, что препарат протеазы из Вас. subtilis — 65, иммобилизованной на активированной 2,4,6-трихлор-1,3,5 — сим-три— азином целлюлозной матрице, промывают О, 1-1 М водным раствором солей органических кислот общей формулы R†(COOM)„, где R — остаток, содержаший от одного до четырех углеродных атомов; M — щелочной или шелочно-земельный металл; n = 1 или 2 (например, ацетаты натрия, кальция или магния, пропионат натрия, валерат натрия, глутаминат натрия, сукпинат натрия и др.}. Промывку повторяют до исчезновения белка в промывных водах. о

Препарат хранят при 4-6 С в виде 1030%-ной суспензии. После хранения в течение 24 мес. сохраняется 45-80% активности. 1 з.п. ф-лы, 2 табл. мывают 0,1 — 1,0 М водным раствором солей органических кислот общей формулы

R-(СООМ)„, где R — С -С вЂ остат: а

M — щелочный или щелочно-земельный металл; п = 1 или 2 (например, ацетаты натрия, кальция или магния, пропионат натрия, валерат натрия, глутаминат натрия, сукцинат натрия и др.).

Промывку повторяют до исчезновения белка в промывных водах. Препарат

1597390 ты, обладающих буферной емкостью на поверхности частиц микрокристаллической целлюлозы. После иммобилизации

5 протеазы на носителе остается некоторое количество активного хлора. При хранении препарата протекает медленный процесс сольволиза, приводящий к локальному и общему понижению рН среды: целлюлоза целлюлоза

Инактивация нейтральной протеаэы в кислой среде протекает с более высокой скоростью, поэтому понижение рБ ухудшает стабильность иммобилизованного препарата. Результаты исследования стабильности иммобилизованной протеазы при длительном хранении (табл, 1) показывают, что специфичес- 25 кая сорбция анионов стабилизирующих добавок является решающим фактором увеличения стабильности. Промывка иммобилизованных препаратов буферными растворами другого состава не оказывает стабилизирующего действия (табл. 1, опыты 11 и 12).

Использование катионов щелочных металлов в составе стабилизирующих добавок также оказывает положительное влияние на стабильность иммобилизованной протеазы. Это можно объяснить тем, что растворы солей щелочноземельных металлов повышают протеолитическую активность как нативного, так и иммобилизованного фермента.

Для иммобилизованной формы фермента этот эффект значительно более выражен, чем для нативного препарата.

Стабилизирующий эффект добавок .понижается с увеличением неполярного остатка R, поэтому предпочтительными стабилизирующими добавками являются ацетаты.

При использовании стабилизирующих добавок в кочцентрациях менее

0,1 М стабильность препаратов постепенно понижается. Применение добавок в концентрациях, превышающих

1 0 М экономически невыгодно, по9

55 скольку увеличение стабилизирующего эффекта не наблюдается.

Полученные препараты иммобилизованной протеаэы из В, subtilis обхранят при 4-6 С в виде 10-30%-ной суспензии в 0,1 И NaC1. Во время промывки используют стабилизирующие добавки в виде 0,1-1I,Î М растворов органических кислот щелочных или щелочно-земельных металлов.

Значительное увеличение стабильности иммобилиэованной протеаэы достигают за счет сорбции анионов кислоладают высокой стабильностью при хранении во влажном состоянии. Способность препарата эффективно удалять некротические ткани и гнойную массу с раненой поверхности сохраняется по истечении 2,5 лет хранения. Препарат в виде мелкодисперсной суспензии можйо наносить тонким, однородным слоем, вводить внутриполостно с помощью иглы или катетера. При применении иммобилизованного препарата или лечении гнойно-некротических ран сокращается срок лечения больного на 4-9 дн. Добавки не оказывают заметного влияния на стабильность нативного фермента.

Растворы нативного фермента в условиях опыта полностью теряют активность при хранении в течение 1 мес. Более выраженный эффект наблюдается только для солей щелочно-земельных металлов (табл. 1, опыт 13), катионы которых подавляют автолиз металлопротеаз.

Пример 1. Стабилизация иммобилизованной протеазы 0,1 И ацетатом натрия. — Целлюлоэный порошок (10 г) суспендируют в 100 мл 0,1 М боратного буфера (рН 9,2), охлаждают до 15 С, добавляют 1 r ТТ, растворенного в 50 мл ацетона, и перемешивают 15 мин, Смесь фильтруют и дважды промывают смесью ацетона с водой (1:1). Осадок суспендируют в 50 мл 0,1 М боратного буфера (рН 8,5) и добавляют 100 мл раствора протосубтилина ГЗх (штамм В. Subtilis-65). Перемешивают 4 ч при 15 С.

Полученный продукт промывают 0,1 M раствором ацетата натрия (порциями до 50-75 мл) до исчезновения белка в промывных водах. Получают 9-9,6 г продукта (в пересчете на сухое вещество). Хранят в виде 20%-ной суспен1597390

Состав промывочного раствора

Опыт

Протеолитическая активность, %, после хранения*, мес.

0 1 2 3 6 12 24

Известный

0,1 М ацетат натрия (пример 1)

0,5 М ацетат кальция (пример 2)

1,0 М ацетат магния (пример 3) 100 58

100 78

125 91

111 80

66 60

71 65 68 61

5 зии в 0,1 M NaC1 при 4-6 С в течение двух лет.

Пример 2. Стабилизация иммобилизованной протеазы 0,5 М ацетатом кальция °

Препарат иммобилизованной протеазы получают по примеру 1, промывают

0,5 М раствором ацетата кальция, хранят в виде 20%-ной суспензии в

О, 1 M NaC1 при 4-6 С в течение двух лет.

Пример 3. Стабилизация иммобилиэованной протеазы 1,0 M ацетатом магния.

Препарат иммобилизованной протеазы получают по примеру 1, промывают 1,0 М раствором ацетата магния (50 мл) и хранят в виде 20%-ной суспензии в 0,1 М NaC1 при 4-6 С в течение,двух лет.

Пример 4. Стабилизация иммобилизованной протеазы 0,075 М ацетатом натрия.

Препарат иммобилизованной протеаэы получают по примеру 1, промывают

0,075 М раствором ацетата натрия и хранят в виде 20%-ной суспензии в

0,1 М NaC1 при 4-6 С в течение двух лет °

Пример 5. Стабилизация иммобилизованной протеазы 1,25 М ацетатом магния, Препарат иммобилизованной протеа-зы получают по примеру 1, промывают

1,25 М раствором ацетата магния и хранят в виде 20%-ной суспензии в

0,1 М NaC1 в течение двух лет.

Данные по изучению протеолитической активности препарата rrp примеру

1-5 приведены в табл. 1.

Пример 6. Стабилизация иммобилизованной протеазы 0,5 М ацетатом кальция.

Препарат иммобилизованной протеазы получа;.от по примеру 1, применяя раствор протосубтилина ГЗх из штамма

В. subtilis-103. Промывают 0,5 H

5 раствором ацетата кальция, хранят в виде 20%-ной суспензии в 0,1 M NaC1 о при 4-6 С в течение двух лет.

Пример 7. Стабилизация иммобилизованной протеазы 0,5 M ацетатом натрия.

Препарат иммобилиэованной протеазы получают по примеру 1, применяя раствор протосубтилина ГЭх из штамма

В. subtilis I-1. Промывают 0,5 М раствором ацетата. натрия, хранят в виде 20%-ной суспензии в 0,1 М NaC1 при 4-6 С в течение двух лет.

Данные но изучению протеолитичес20 кой активности препарата по примерам 6 и 7 приведейы в табл. 2.

Формула изобретения

25 1. Способ стабилизации протеазы

Bacillus subtilis, иммобилизованной посредством активации целлюлозной матрицы 2,4,6-трихлор-1,3,5-сим-триаэином, обработкой препарата после иммобилизации раствором соли, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью увеличения стабильности препарата при храненчи, обработку препарата после иммобилизации проводят раство35 ром соли органической кислоты общей формулы

R- (СООМ) „, где R — С -С -остаток;

М вЂ” щелочной или щелочно-земельный металл; п = 1 или 2.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что обработку препарата проводят 0,1-1,0 М раствором соли орга45

Таблица 1

37 26 12 1 0

85 85 87 81 80

1597390

Продолжение табл. 1!

Состав промывочного раствора

Опыт

100, 69

54

43 .37

69 65

68 67

62 64

54 51

53 65

113 ?8

100 67 .

100 85 !

00 62

100 50

68

62

67

52

60 58

60 58

61 56

48 .45

63 48

0 0

3 0

93 51

97 58

33

25

* За 100% принимается активность препарата перед обработкой стабилизирующими добавками.

* Нативный фермент хранят в 0,1 М ацетата кальция.

Та блица ° 2

Протеолитическая активность, %, после хранения, мес.

Пример Состав промывочного раствора

0,5 М ацетат кальция 100 73 70 58 55 57 55

0 5 М ацетат натрия 118 89 73 64 72 69 61

Составитель А.Семенов

ТехредM.Дидык Корректор M.Ïîæî

Редактор И.Дербак

Тираж 487 Подписное комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 3032

ВНИИПИ Государственного

113035, Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ул(город, ул. Гагарина, 101

0,075 M ацетат натрия (пример 4)

6 1,25 М ацетат магния (пример 5)

7 0,5 М пропионат натрия

8 0,5 М валерат натрия

9 0,5 М глутамат натрия

10 0,5 М сукцинат натрия

11 0,1 M фосфатный буфер (рЕ1 7,0)

12 0,1 М боратный буфер (рН 8,0)

13 Нативный фермент

0,1 M ацетат кальция**

Протеолитическая активность, %, после хранения*, мес.

0 1 2 3 6 12 24

0 1 2 3 6 12 24