Способ получения макропрепаратов культур бактерий

 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для изучения морфологии колоний микроорганизмов и их биохимических свойств. Для повышения качества препаратов и упрощения способа в качестве консерванта, которым покрывают колонии бактерий, выращенных на твердых питательных средах в оптимальных для их роста условиях, используют жидкий форполимер метилметакрилата, приготовленный путем неполной полимеризации смеси следующего состава, мас.%: диоктилфталат 5-20

азобисизобутиронитрил 0,5-1

метилметакрилат остальное. Полимеризацию консерванта осуществляют на воздухе при комнатной температуре. Макропрепараты, полученные предлагаемым способом, хорошо просматривается на плотных питательных средах, сохраняя морфологию бактериальных колоний и специфические проявления биохимической активности в течение 12 мес. 1 з.п.ф-лы, 1 табл.

союз сОВетских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4459645/30-13 (22) 12. 07.88 (46) 07.10.90. Бюл. Р 37 (71) Свердловский государственный медицинский институт (72) А.В.Казаков, А.Г.Теслер и А.В.Свистунов (53) 577.15(088.8) (56) Пиэ Д. Гистологическая техника в электронной микроскопии. M.: Иностранная литература, 1963, с. 47-51.

Билько И.П.. Методика получения макропрепаратов культур микроорганизмов для научно-педагогических целей. — Лабораторное дело, 1986, и 8, с. 508. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МАКРОПРЕПАРАТОВ

КУЛЬТУР БАКТЕРИЙ (57) Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для изучения морфологии колоний микИзобретение относится к микробиологии и может быть использовано для изучения морфологии колоний микроорганизмов и их биохимических свойств.

Целью изобретения является повышение качества препаратов и упрощение способа.

Сущность способа заключается в том, что выполненные на твердых питательных средах бактериальные культуры заливают жидким форполимером метилметакрилата и выдерживают на воздухе при комнатной температуре до окойчания полимеризации. Форполимер (или олигомерный полиметилметакрилат) готовится путем неполной полимериза (51)5 С 12 N 1/04, 11/00// (С 12 N 1/04, С 12 К I:01) 2 роорганизмов и их биохимических свойств. Для повышения качества препаратов и упрошения способа в качестве консерванта которым покрывают колонии бактерий, выращенных на твердых питательных средах в оптимальных для их роста условиях, используют жидкий форполимер метилметакрилата, приготовленный путем неполной полимеризации смеси следующего состава, мас.%: диоктилфталат 5-20; азобисизобутиронитрил 0,5-1; метилметакрилат остальное. Полимеризацию консерванта осуществляют на воздухе при комнатной температуре. Макропрепараты, полученные предлагаемым способом, хорошо просматриваются на плотных питательных средах, сохраняя морфологию бактериальных колоний и спе цифические проявления биохимической активности С в течение 12 мес. 1 з.п. ф-лы, 1табл. ции смеси следующего состава, мас.%: метилметакрилат 80-95; диоктилфталат

5-20; аэобисиэобутиронитрил 0,5-!; и содержит 30-40% свободного мономера — метилметакрилата. Различные варианты составов полимера являются промежуточными продуктами в производстве органического стекла. При необходимости фбрполимер метилметакрилата можно легко получить в лабораторных условиях простым смешением исходных компонентов. При этом в него для ускорения процесса окончательной полимеризации (отверждения) добавляют дивинильный мономер — технический дивинилбензол — в количестве

5-10% от массы форполимера.

1597382

Для приготовления форполимера метилметакрилата метилметакрилат смешивают с диоктилфталатом и азобисизобутиронитрилом в массовом соотношении

9:1:0,005. Смесь нагревают в закрытой стеклянной емкости на водяной бане при 50 С в течение 20 ч, периодически перемешивая. Образующуюся вязкую прозрачную массу храйят в темной гер- 1О о метично закрытой емкости при 4 С в течение 2 педель и используют по мере необходимости.

Выращивают любые необходимые микробные культуры на соответствующих плотных питательных средах в пробирках или чашках Петри при соблюдении всех требуемых условий их культивирования. Выращенные культуры заливают жидким форполимером метилметакрилата .исходя из расчета 5-10 мл полимера на одйу пробирку или чашку. Окончательная полимеризация осуществляется при комнатной температуре в течение

24 ч. Затем пробирки закрывают рези- 25 новыми или ватно-марлевыми пробками и парафинируют, а чашки Петри герметизируют крышками,, смазывая внутреннюю поверхность последних указанным полимером.

Качество препаратов в зависимости . от состава форполимера и режима полимеризации, рассмотрим на примерах 1-13, результаты .которых приведены в таблице.

Как видно из таблицы, при концентрациях свободного метилметакрилата, выходящих за пределы предлагаемых (примеры 1, 2, 6 и 7), ухудшается качество препарата или из-за помут- 4О нения полимера, или из-за невозможности длительной фиксации. Концентрацию свободного мономера — метилметакрилата — определяют путем вакуум-отгонки при остаточном давле- 45 нии, равном 3 мм рт. ст., и конденсации в ловушке, охлаждаемой смесью

О сухого льда и метанола до -80 С.

Помер 2 демонстрирует отрицательное влияние на качество препарата повышенной температуры полимеризацйи.

5О

Для сравнения приведены результаты известных способов (примеры 12 и 13) .

Примеры 8 и 9 демонстрируют суще55 ственность интервала концентрации диоктилфталата, а примеры 10 и 11 интервала концентраций азодиизобутиронитрила.

Разработанный способ получения макропрепаратов испытан на культурах бактерий различных родов, полученных из следующих коллекций.

Из коллекции ГИСК медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича: Alcaligenes faecalis CCN

1052; Bacillus cereus ССМ 20 10; Bordetella pertussis АТСС 979/; Citrobacter freund Во 35/57, IHE (1974);

Corynebacterium diphtheriae (Granis

toxigenic) 45, НИИВС, Москва (1955);

Entегоbacter aегоgenes 2531 ССМ (1979); Escherichia coli Г-41, 026:

К60 (1958), U 9-41, 02:К1:Н4 (1950), U 5-41, 01:К1:Н7 (1950), Крым 1274, 0151:К-:Н10 (1965), М17 (1962);

Hafnia alvei 130 (1979); Klebsiella

pneumoniae К80 PZH (1966); Micrococcus luteus (lysodeikticus) CCM 169;

Nicrococcus varians (Sarcina lutea)

АТСС 9341; Neisseria gonorrhoeae 27, УКВИ (1975); Neisseria meningitidis . (группа А) 2 см, ГИСК (1976); Salmonella typhI 214, ЦНИИЭ (1971); Salmonella typhimurium 441, ЦНИИЭ (1976); БЬ gella dysenterial 2575

НИИВС, Тбилиси (1963); Shigella Sonnec, "S form" НИИВС, Москва (1971);

° Staphylococcus aureus "Панюков" (1943), 209-р (1948), 5 (1955); Cowan I, Cowan II, Cowan IXI, Staphylococcus epidermidis, ССМ 2124 (1980), АТСС 14990; Staphylococcus saprophyticus ССМ 883; Streptococcus group А (Streptococcus pyogenes) 1512 (1953);

Streptococcus faecalis (var liquefaciens) группа Д 5/63 (1964) .

Из коллекции профессора Зеелигера (ФРГ, 198 1): Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) 1/2а, За, 4а, 5;

6Ъ,. 7, С-52; L ° Ivanovii 7842, L,See1 @ег 100100; Ь. Melshimer i 8149;

L. Grayi- С-214; L. Nurrayi G-44;

L. Innocua 8011; L. Denitrificans

С-670.

Из разных коллекций. "Bacillus subtilis 83, ИЭМАУ СССР (1952), Proteus

vulgaris 1, Медицинский институт, Пермь (194 1), Proteus mirabilis

"Елейкин", НИИЭМ, Казань (1968), Pseudomonas aeruginosa 6f, Институт теоретической медицины АН БССР, Минск (1949), Serratia marcescens 7, Институт теоретической медицины АН БССР, NHHcK (1951) Listeria monocytogenes

634 ВНИИВВиМ (1971), 9-72 ВГНКИветСостав смеси, нас.l

Пример

Реяин отверкдения полимера: температура, C (время, ч) Концентрация свободного нананера

Признаки препаратов

Пластификаторы Инициаторы

Основа (иетилВид границы культура-полнПуэы- Состояние

Фиксированность свойств полимерного слоя рн

Либутил- Днах- Перекись фталат тил- беиэопля фталат

Лзодиизобутиронитрил мета крнлат) воздуха культуры нер

80,0

22 (48) 19 5

0,5

Расплыв- Нет чатая

Нсваэмок"

Мутный ность фиксации

Неваэмок89,0

47 (24) 10,0

1,0

1О

Недостаточная ность длл тельной фиксации

Вазмакчеткость

Четкая

19,5

3 80,0

22 (48) 0,5

lT p D s рачный ность длительной фиксации

80,0

22 (48) 19,5.

0,5

Четкая

Нет

Прозрачный

5 80,0

G 80,0

19,5

19,5

0,5

0,5

Нееоэмакность ллиЕсть тельной фиксации

80,0

8 25,0

I и

19,5

24,5

0,5

0,5

Мутный

Проз— рачный

Нет

Расплгсвчатая

15973 препаратов (1958) 9-1?9, ЕГНКИветпрепаратов (1958), 9-127 ВГНКИветпре:паратов -(1958), 1197, ВГНКИ ветпрепаратов (1952) .

Для получения макропрепаратов культур микроорганизмов на основе форполимера метилметакрилата требуется значительно меньше временных и материальных затрат по сравнению с известным способом получения аналогичных препаратов на основе ПААГ, поскольку устраняется необходимость приготовления отдельных компонентов

ПААГ, их смешивания в определенном

,соотношении и применения таких анти15 бактериальных средств, как формалин или этиловый спирт. Применение форполимера метилметакрилата дает возможность готовить макропрепараты культур микроорганизмов на питательных средах в чашках Петри, поскольку после окончательной полимеризации он образует твердую бесцветную прозрачную структуру с гладкой поверхностью. Кроме того, форполимер метилметакрилата при контакте с питательными среда)я(и культивируемыми на них микроорганизмами не вызывает изменения их внешнего вида и не изменяется сам.

Преимущество предлагаемого способа заключается в том, что предлагаемый состав полимеризующейся смеси и режим ее отверждения обеспечивают значительное улучшение качества макропрепаратов по сравнению с извест- 35

I ными способами (четкость границы культура — полимер, отсутствие пузырьков воздуха на поверхности питатель21ой среды и в блоке полимера, прозрач40

82 б ность полимерного слоя, возможность длительной фиксации морфологических свойств и прижизненной биохимической активности микробных культур на различных селективных и дифференциальнодиагностических средах без каких-либо воспринимаемых визуально или с помощью микроскопа изменений размеров, формы, окраски, консистенции характера поверхности, структуры этих культур и самих сред).

Формула и з о б р е т е н и я

1. Способ получения макропрепаратов культур бактерий, включающий выращивание микробных культур на плотных питательных средах в оптимальных для роста условиях и помещение их под слой. жидкого консерванта с последующей его полимеризацией, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения качества препаратов и упрощения способа, в качестве консерванта используют жидкий форполимер метилметакрилата, содержащий 30-40Х свободного метилметакрилата, а полимериэацию консерванта осуществляют на воздухе при комнатной температуре.

2. Способ по и. 1, о т л и ч а ташийся тем, что форполимер метилметакрилата получают путем смешигания диоктилфталата. азобисизобутиронитрила и метилметакрилата при следующем соотношении компонентов, мас.7.:

Диоктилфталат 5-20

Азобисизобутиронитрил 0,5-1

Иетилметакрилат Остальное

1597382

Продолжение таблицы

Состав снеси, мас.2

Пример

Признаки препаратов

Пластнфикаторы

Инициаторы

Состояние полинерлого слоя

Дибутилфталат

Диоктилфталат

Перекись ЛзоцнПенэоила изооутироНитРНЛ з

9 97,0

1О 80,0

2,5

19,8

0,5

0,2

Есть

Нет

11 80,0

12 88,0 о

18,5 1,5 35

Есть

2,0

Расплывчатав

50 (12) 10,0

Невознонность фиксацни и

47 (24) о

1,0

10,0

13 89,0

Составитель В.Соина . ТехредМ.Дидык Корректор M.Пожо

Редактор С.Пекарь

Тираж 495 Подписное комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 3032

ВНИИПИ Государственного

113035, П изводственно-издательский комбинат Патент, г.ужгород, ул. Гагари а,1

11 II

Г í 101 рои

Основе (нетилнетакрылат) Концентра ция снолодного нонокера

Ренин отвервдения полинера: тенператуРаьеС (время, ч) Вид границы культура-полимер

Четкая

Расппыв-; цатан

Четкаа

Пузыри воздуха

Непрозрачный

Прозрачный

Мутный

Фиксированность свойств культуры