Способ получения лейциновой т-рнк

 

Изобретение относится к молекулярной биологии, в частности к способам выделения индивидуальных транспортных рибонуклеиновых кислот (тРНК). Целью изобретения является - упрощение способа и повышение чистоты выделением МРНК. СПОСОБ ЗАКЛЮЧАЕТСЯ В ТОМ, ЧТО РЕАКЦИЮ СВЯЗЫВАНИЯ АМИНОГРУППЫ АМИНОКИСЛОТНОГО ОСТАТКА АМИНОАЦИЛИРОВАННОЙ ТРНК проводят с альдодекстраном, а стадию отделения образовавшегося продукта от несвязанных тРНК осуществляют на ДЕАЕ-целлюлозе.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК ((91 SU (ill (1) С 12 N 15/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4467801/30-13 (22) 29.07.88 (46) 07.10.90. Бюл. Р 37 (71) Ленинградский институт ядерной физики им. Б.П.Константинова (72) Л.С.Исаева-Иванова, С.Н.Дробченко, С.А.Грачев, Г.Н.Бондарев и Е.В.Энейская (53) 547.963.3(088.8) (56) С. Mam I. et а1. — Biochemistry !

1968, v. 7, Р 10, р. 3459.

Goss D.V., Parkhurst L.S. — Biol.

Chem., 1978, v. 253, 1Ф 21, р. 7804.

Изобретение относится к молекулярной биологии, в частности к способам выделения индивидуальных транспортных рибонуклеиновых кислот (тРНК).

Целью изобретения является упрощение способа и повышение чистоты тРНК.

Способ заключается в том, что выделяют тРНК, проводя реакцию аминоацилирования вьделяемой тРНК, связывают аминогруппы аминокислотного остатка аминоацилированной тРНК, отделяют образовавшийся продукт от несвязанных тРНК, проводят щелочной гидролиз и осуществляют дальнейшее вьделение тРНК, при этом реакцию связывания аминогруппы аминокислотного остатка аминоацилированной тРНК проводят с альдоенолдекстраном мол. мас.

500000 и степенью окисления 25-50 при рН 5,5-6,0, а стадию отделения образовавшегося продукта от несвязан- . ных тРНК осуществляют на ДЕАЕ-целлюлозе.

2 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЛ ЛЕЙЦИНОБОЙ -,PÖÊ (57) Изобретение относится к молекулярной биологии, в частности к спосо.бам выделения индивидуальных транспортных рибонуклеиновых кислот (тРНК).

Целью изобретения является упрощение способа и повышение чистоты вьделения тРНК. Способ заключается в том. что реакцию связывания аминогруппь(аминокислотного остатка аминоацилированной тРНК проводят с альдоенолдекстраном, а стадию отделения образогавшегося продукта от несвязанных тРНК осуществляют на ДЕАЕ-целлюлозе.

Пример 1. Получение альдоенолдекстрана мол. мас. 500000 и степенью окисления 25.

К 2,4 r декстрана мол. мас.

500000, растворенного в 50 мл дистиллированной воды, добавляют 2,1 г периодата натрия, растворенного в

50 мл Н О, рН реакционной среды доводят до 3 бикарбонатом натрия. Реакцию ведут 1 сут. От низкомолекулярных примесей избавляются 10-дневным диализом против дистиллированной воды с рН 5,8. Получают 120 мл готового продукта с концентрацией 15 мл,",льдоенолдекстрана на 1 мл раствора.

Данный продукт хранится без измеО нений в течение 6 мес. при 4 С. Определяют количество альдогидридных групп. Оно равно 50 на 100 звеньев декстрана, соответственно степень окисления декстрана равна 25.

Синтезируют альдоенолдекс тран структуры

С, С и O НО }- 750

5Î который является удобным высокореакционным реагентом для связывания с аминогруппой аминоацилированной

1О тРНК.

Пример 2. Выделяют лейциновую тРНК из Escherichia coli на

ДЕАЕ-целлюлозе.

Связывают аминогруппы аминолейциновой тРНК с альдоенолдекстраном.

Аминоацилирование лейциновой тРНК проводят с лейцином, меченным по С. ф

К 240 ед. суммарной тРНК, в составе которой находится аминоацилированная лейциновая тРНК,, растворенной в 1 мл дистиллированной воды, добавляют

2 мл водного раствора альдоенолдекстрана концентрации 15 мг в 1.мл. Для удаления РНКаз из реакционной смеси добавляют 4 мг бептонита. Реакцию ведут в течение 48 ч (рН дистиллированной воды 5,5-6,0) при 4 С., Стадия выделения декстранаминоацилировапной тРНК. Для отделения декстран-лейциновой тРНК от избытка .,альдоенолдекстрана и непрореагировавших тРНК реакционную смесь наносят на колонку, запопненную ДЕЛЕ-целлюлозой, размером 12 х1 см. Элюирование

35 сначала проводят низкой ионной. силой:

50 МКоАс буфером, рН 4,5 и 0,2 М

NaCl (буфер № 1). При этом выходит альдоенолдекстран и декстранлейциновая тРНК.

После достижения нулевой плотности (А нм) проводят смену элюирующего буфера: 50 М КоАс, рН 4,5 и

1,5 М NaC1 (буфер N - 2). Высокой ионной силой вымывается вся непрореагировавшая тРНК. Контроль за вымыванием с колонки продуктов проводят по измерению плотности на А <<О и радиоактивности по "С.

По плотности вымывают 12 ед. тРНК (3 ед. плотности — вклад поглощения альдоенолдекстрана), т.е. 1007. индивидуальной лейциновой тРНК, по актив,ности — 85% (следует учесть, что наличие соли при выделении гасит счет),.

55 фракцию (с 10 по 18 мл), содержащую декстранлейциновую тРНК, гидролизуют по сложноэфирной связи при рН

8,9 в трисовом буфере в течение 12 ч при 20 С. Смесь после гидролиэа наносят на колонку с ДЕАЕ-целлюлозой.

Элюирование отгидролизованной декстранлейциновой аминокислоты проводят буфером ¹ 1, элюирование деацилированной лейциновой тРНК проводят буфером № 2. Лейциновую РНК переосаждают из этанола.

Проводят проверку биологической активности выделенной лейциновой тРНК с помощью ферментативного аминоацилирования лейциновой аминокислотой удельной радиоактивностью 1-45 рМ.

Обогащение 1200 рМ на 1 ед. лейциновой тРНК, что соответствует мировым стандартам. Для аминоацилирования используют суммарную синтетазу и поэтому обогащение получается чуть ниже ожидаемого.

Проверка, чистоты выделяемой тРНК.

Для подтверждения чистоты выделяемой индивидуальной тРНК проводят электрофорез. Образец тРНК денатурируют в смеси 50Х формалина и 6Е формальдегида в течение 10 мин при 65ОС. Электрофорез проводят íà 10Х-ном полиакриламидном геле в 0,1 М трисборатном буфере рН 8,3 и 7 M мочевине 4 ч, 200. Окраска метиленовой синькой. На электрофореграмме видно, что одна полоса соответствует лейциновой тРНК, отсутствие других полос указывает на высокую степень очистки индивидуальной тРНК, а также на то, что выделяемая по предлагаемому способу, тРНК в процессе очистки не деградирует.

Для проверки чистоты выделенной тРНК проводят исследования взаимодей. ствия неаминоацилированных тРНК с альдоенолдекстраном.

К 240 ад. неаминоацилированной тРНК, растворенной в 1 мл дистиллированной воды, добавляют 2 мл водного раствора альдоенолдекстрана. Условия проведения реакции, как в примере 2.

Далее наносят на ДЕАЕ-целлюлозу и моют буфером М 1. С колонки вымывается чистый альдаенолдекстран, не связанный ни с одной.тРНК, что свидетельствует об отсутствии примесей

Составитель С;Бандрин

Техред И.Дидык Корректор М.Пожо

Редактор С.Пекарь

Заказ 3032 Тираж 495 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101

5 159739 других тРНК в выцеленной индивидуальной тРНК, а значит, и ее чистоте.

Аналогично выделению лейциновой тРНК проводят выделение любой из

20 аминокислот.

Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает высокую чистоту индивидуально выделяемых тРНК, высокий (100X) выход. Способ прост в осуществлении, так как не содержит ника,ких уникальных операций и сложного оборудования, используются отече- ственные препараты.

Ф о р и ул а и з о б р е т е н и я

Способ получения лейциновой тРНК, включающий выделение тРНК, проведе1 6 ние аминоацилирования тРНК, связывание аминогруппы аминокислотного остатка аминоацилированной тРНК, отделение образовавшегося продукта от несвязанных тРНК, проведение щелочного гидролиза и дальнейшее выделениетРНК,отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и повышения чистоты тРНК, связывание аминогруппы аминокислотного остатка аминоацилированной тРНК проводят с альдодекстраном мол. мас. 500000 и степенью окисления 25-50 при рН

5,6-6,0, отделение образовавшегося продукта от несвязанных тРНК осуществляют на ДЕАЕ-целлюлозе,