Способ оценки мутагенности неприродных вставок в днк

 

Изобретение относится к генетической инженерии и может быть использовано для анализа мутагенности IN VIVO. Цель изобретения - повышение чувствительности способа. Способ включает гибридизацию однотяжевой ковалентно замкнутой кольцевой ДНК ((+)-цепь) фага М13 MP 8 OP с ECORI/HIND III - фрагментом ((-)-цепь) ДНК фага М13 MP 80 OPR и 30-ти звенным ECOR 1 - HIND III фрагментом ДНК фага М 13 MP 8, содержащим модификацию, трансфекцию полученным гибридом клеток E.COLI ВМН 71-18 MUTS с нарушенной системой репарации. Отбор фагов - потомков только цепи ДНК, содержащей исследуемую модификацию, титрование на несупрессорных клетках E.COLI МК 30-3. АНАЛИЗ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ ДНК отобранных фагов позволяет не только выявить качественные изменения в них, но и однозначно связать мутации с исследуемыми неприродными вставками, а также оценить вероятность их появления.

СООЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (gl)g С 12 N 15/00 ювао,ю

РАП!1|!!; - сii A IECHAR

gggpi,iQ т -,А

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4468340/30-13 (22) 27. 07. 88 (46) 07. 10. 90. Бюл, N 37 (71) МГУ им. N.Â.Ëîìîíîñîâà (72) В.Л.Друца (53) 5?7.113.6(088.8) (56) Nucl Acids Res 1984, В 12, р. 9441. (54) СПОСОБ ОЦЕНКИ МУТАГЕННОСТИ НЕПРИРОДНЫХ ВСТАВОК В ДНК (57) Изобретение относится к генетической инженерии и может быть использовано для анализа мутагенности in

vivo. Цель изобретения — повышение чувствительности способа. Способ включает гибридизацию однотяжевой ковалентно замкнутой кольцевой ДНК ((+)Изобретение относится к генетической инженерии и биотехнологии и может быть использовано для анализа мутагенности in vivo лекарственных препаратов направленного действия, сконструированных на базе модифицированных синтетических олигонуклеотидов.

Целью изобретения является повышение чувствительности способа.

Проводят гибридизацию однотяжевой кольцевой ковалентно замкнутой

C(+)-цепь) PHK фага N13mp8op, которая отличается от стандартной ДНК фага М13шр8,только G/Ñ -" Т/А за,меной в положении 624 1, приводящей к появлению несупрессируемого ора1 стоп-кодона в рамке считывания Z-фрагО9)® (ill 1Д 9 А 1

2 цепь) фага М13шр8ор . с EcoR1/IIind

III — фрагментом ((-) -цепь) ДНК фага N13mp8opr и 30 — звенпым coR1 ,Hind III фрагментом ДНК фага N13 mp8, содержащим модификацию, трансфекцию полученным гибридoM клеток Г. coli

LNH 71-18 muts с нарушенной системой репарации. Отбор фагов — потомков только цепи ДНК, содержащей исследу— емую модификацию, титрование на несупрессорных клетках Е. coli NI(30-3.

Анализ первичной структуры ДНК отобранных фагов позволяет не только выявить качественные изменения в них, но и однозначно связать мутации с исследуемыми неприродными вставками, а также оценивать вероятность их появления. мента гена р-галактоэидаэы с 30звенным тест-олигопуклеотидом, комплементарным (+)-цепи ДНК фага М13

mp8 и несущим .исследуемую модификацию, и (-)-цепью большого ЕсоК1/

Hind III-фрагмента двутяжевой ДНК фага M13mp8opr, способного размножаться на несупрессорных клетках

Е ° coli. Тест-олигонуклеотиды с модификациями получают либо путем пряI мого химико-энзиматического синтеза, либо вводят в них модификации методом химического лигирования. ДНК получают из соответствующих фагов N13mp8op и M13mp8opr, сконструированных с помощью стандартной гэп-дуплексной технологии иэ фагов М13тр8 и М13шр9г соответственно.

1597392

Учитывая структуру использованных для конструирования гетеродуплекса фрагментов ДНК и их функции кольцевая отнотяжевая ДНК служит матрицей для получения кольцевой ковалентно замкнутой гетеродуплексной фаговой

ДНК; олигонуклеотид несет модификацию и маркер (нет ора1 стоп-кодона и реплики с ДНК, куда он встроен, 1О должны в случае отсутствия мутагенеза давать полноценный Z-фрагмент гена

Р-галактозидаэы, обеспечивающий на, РТС/Х вЂ” gal-среде голубую окраску бляшек фагов); большой EcoR1/Hind

III-фрагмент ДНК-фага М13тр8орг обеспечивает на несупрессорных клетках отбор только фагов, ДНК которь|х являются репликами (-) -цепи, несущей модификацию j, для анализа потомства есть 2п возможность использовать быстрый метод pa< ïosnaÂanèÿ реплик отдельных . цепей гетеродуплекса и обнаруживать делеционно-вставочные мутанты. Если использовать для титрования стандарт- 25 ную технику верхнего агара на среде, содержащей индикаторную смесь IPTG +

+ Х-gal, то на несупрессорных клетках MK 30-3 оттитруются фаги потомки только (-)-цепи (модифицированной) гетеродуплекса: немутантные (голубые бляшки) и делеционно-вставочные мутанты {неокрашенные бляшки), причем и те, и другие имеют в области

624 1-ro нуклеотида структуру синтети35 ческого тест-олигонуклеотида. В те же условиях на супрессорных клетках ВМН

71-18 титруются фаги — потомки (+)— цепи (неокрашенные бляшки, 624 1-й нуклеотид тот же, что и в фаге

M13mp8op) и фаги — потомки (-) -цепи (голубые бляшки — немутантные, неокрашенные бляшки — мутанты).

Таким образом, после выделения

ДНК из отобранных клонов фагов и определения их первичной структуры в области полилинкера можно однознач- но приписать выявленные случаи мутантгенеза наличию в синтетическом олигонуклеотиде модифицированного узла, а по соотношению мутантных и немутантных клонов легко определить вероятность генерации мутаций.

П р и и е р 1 (контрольный). Конструирование гетеродуплексной ДНК.

1 икг однотяжевой ДНК фага M13mp8op

55 и 0,5 мкг больи|ого EcoR1/Hind III фрагмента ДНК вЂ” фага M13mp8opr нагревают в 90 мкл ТЕ-буфера 3 мин прн

100 С, быстро охлаждают, добавляют о

10 мкл 10»-SSC-буфера и отжигают 24 ч при 65 С. Осаждают ДНК 3 объемами этанола, растворяют в 30 мкл воды, добавляют 10 мкл 5»-лигазного буфера (0,1 мМ ATP) и 10 мкл водного раствора немодифицированного олигонуклеотида) pAGCTTGGCTGCAGGTCGACGGATCCCCGGG (0,001 О.Е. zaa). Смесь нагревают

10 мин при 60 С и медленно (3 ч) охлаждают до комнатной температуры.

Добавляют 1 мкл раствора фермента Т4

ДНК-лигазы (50 ед. акт.), выдерживают 2 ч при комнатной температуре, долавляют 1 мкл Т4-ДНК-полимеразы (20 ед. акт.) и выдерживают еще 6 ч.

Далее смесь прямо используют для тпансфекции компетентных клеток ВМН.

71-18mutS.

Трансфекцию и титрование фаговпотомков проводят следующим образом.

50 мкл обработанного ферментами гетеродуплекса смешивают с 50 мкл

0,1 М СаС1 и 200 мкл компетентных клеток Е. coli ВМН 71 — 18muts в 0,05 М

CaCl2, выдерживают 2 ч во льду, прогревают 3 мин при 45 С, добавляют о мл питательнои среды dyt и перемешивают 1 ч при 37 С, 100 мкл смеси разбавляют 10 мл среды dyt и перемео шивают ночь при 37 С. Суспензию центрифугируют, из супернатанта отбирают аликвоту, разбавляют и титруют содержащиеся в ней фаги на IPTG/Х-gal-чашках, используя в качестве реципиента клетки MK 30-3 (или для контроля

BMII 71-18). Подсчитывают количество голубых и неокрашенных бляшек фагов.

Доля неокрашенных бляшек на газоне

МК 30-3 характеризует вероятность генерации мутаций. Наращивают фаги индивидуальных колоний, выделяют фаговую ДНК и секвенируют ее в области полилинкера дидезоксиметодом Сэнгера.

Так определяют характер мутаций и по наличию маркера (6241 †G/С-пара) проводят строгое отнесение секвенированных фагов к семействам потомков (+) — или (-)-цепей исходного гетеродуплекса со встроенным в (-)-цепь модифицированным узлом.

В контрольном эксперименте обнаруживают, что на газоне МК 30-3 все блянп<и (титр 4,7 10 ) голубые (мутагенеза нет), а на газоне BMH 71-18 есть бляшки голубые (4,0 .10 ) и белые (титр 3,3.10").

Таким образом, способ позволяет выявить мутагенность неприродных вставок в ДНК.

Составитель Т.Забойкина

Техред М.Дидык Корректор M.Ïîæî

Редактор И.Дербак

Заказ 3032 Тираж 49 1 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина,101

5 159

Пример 2. Проводят аналогич — но примеру 1, но с олигонуклеотидом

pAGCTTGppGCTGCAGGTCGACGGATCCCCGGG, содержащим межнуклеотидную пирофосфатную группировку (-рр-). На газоне

МК 30-3 есть только голубые бляшки (титр 5,1 10 ). Всего просматривают

11324 бляшки; матагенеза нет, точнее вероятность генерации делеционновставочной мутации межнуклеотидной пирофосфатной группировкой не выше

;-10 (уровень спонтанного мутаге4 неза в клетках ВМН 71-18muts) . Структура ДНК клона соответствует ДНК фага

Ni3mp8r, мутаций нет.

Пример 3. Проводят аналогично примеру 1, но с олигонуклеотидом рАССТ Ц:р (СН й) и pGCTGCAGGTCGACGGATCCCCGGG содержащим межнуклеотидную эти- . ленгликольную вставку (-р(СН ) -).

На газоне МК 30-3 бляшек фага нет: полностью блокирована репликация модифицированной (-)-цепи.

На газоне ВМН 71-18 все бляшки не окрашены (титр 1,7 101) Структура

ДНК клона соответствует ДНК фага

М13mp8op. Система работает, репликация (+) -цепи идет нормально..

7392 6

Формула иsoбpетения

Способ оценки мутагенности неприродных вставок в ДНК путем гибридизации (+)-цепи фага с фрагментом (-)-цепи того же фага и олигонуклеотидам, несущим исследуемую неприродную вставку и комплементарным. участ1п ку (+)-цепи, устранения разрывов, трансфекции полученной ДНК клеток

Escherichia co1i ВМН 71-18muts (sup+, rep-), титрования фагов-потомков на клетках Escherichia col i МК,30-3 (sup-.

15 хер ), оценки результатов, о т л ич а ющи и с я тем, что, с целью повышения чувствительности способа, в качестве (+) -цепи используют однотяжевую ДНК фага M13mp8op, содержа20 щую несупрессируемый стоп-кодон в области полилинкера и супрессируемые стоп-кодоны в структурных генах, а в качестве (-) -цепи — (-) -цепь большого ЕсоК1 — Hind III фрагмента ДНК

25 фага M13mp8opr, способного размножаться в несупрессорных штаммах Escherichia coli, в качестве олигонуклеотида — синтетический 30-эвенник, комплементарный (+) †це малого EcoRl

30 Hind III фрагмента фага M13mp8, а мутагенность оценивают по частоте появления мутантов, выявляемых прямым сиквенсом ДНК фагов, способных pssмножаться в несупрессорных клетках штамма Escherichia coli MK 30-3. !