Способ определения антител к вирусу иммунодефицита человека в крови

 

Изобретение относится к области медицины, конкретно к иммунодиагностике синдрома приобретенного иммунодефицита, и может быть использовано для определения наличия антител к белкам вируса ВИЧ в крови. Цель - повышение чувствительности и упрощение способа. В предлагаемом способе определения антител к белкам ВИЧ применяют SDS-электрофорез в градиентном 4-20%-ном акриламидном геле, вируссодержащий материал - экстракты вируспродуцирующих клеток лимфобластоидной линии НТА-4. Разделенные в акриламидном геле до индивидуальных белковых полос антигены ВИЧ переносят методом электропереноса на нитроцеллюлозный фильтр, вирусные антигены идентифицируют и полосы нитроцеллюлозных фильтров, соответствующие белкам р24, р55, др 41, др 120, вырезают и фрагменты этих полос монтируют нитроцеллюлозным клеем на специальную бумажную пластинку, формируя Диагностическую полоску. Активную часть Диагностической полоски, представляющую собой 4 фрагмента нитроцеллюлозных фильтров, каждый из которых несет на своей поверхности один белок ВИЧ : р24, р55, др 41, др 120, погружают в анализируемую сыворотку, разведенную 1:50 физиологическим раствором. После инкубации Диагностическую полоску проявляют с использованием антивидового конъюгата, аналогично иммунологическому проявлению способа - прототипа - Вестернблот. Для повышение достоверности результатов анализа при иммуноферментном определении используют два маркерных фермента - β - лактамазу из BACILLUS LICHENIFORMIS и пероксидазу хрена.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

А1

ÄÄSUÄÄ1597 28 (51)5 G 01 N 33/535

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А BTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГННТ СССР

1. (.2 1 ) 44 54 8 76 /30-14 (22) 15. 06.88 (46) 07. 10.90. Бюл. Nl 37 (71) Институт прикладной молекулярной биологии и Московский научно-исследовательский, институт вирусных препаратов (72) А.IO.Ñaçûêèí, И.A.Îêóíåâ,Ю.Ю.Венгеров, С.С. Маренникова, Г.P.Èàöeâè÷, Л.Г.Степанова, Г.П.Иванов, Е.А.Грамоткина, Е.С.Северин и О.Г.Анджапаридзе (53) 615.375(088.8) (56) Березин В.Э. и др. Иммунодиагностика вирусных антигенов и антител .к вирусным антигенам методом иммунного (Вестерн) блотинга. — 1 ..: AMH СССР, МФ СССР, 1986. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К

ВИРУСУ ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА В КРОВИ (57)Изобретение относится к области медицины, конкретно к иммунодиагностике синдрома приобретенного иммунодефицита, и может быть использовано для определения наличия антител к белкам вируса ВИЧ в крови. Цель повышение чувствительности и упрощение способа. В предлагаемом способе определения антител к белкам ВИЧ применяют SDS-электрофорез в градиентном

4-20%-ном акриламидном геле, вирусИзобретение относится к медицине,,а именно к иммунодиагностике синдрома приобретенного иммунодефицита, и может быть использовано для определения наличия в сыворотке крови чело2 содержащий материал — экстракты вируспродуцирующих клеток лимфобрастоидной линии НТА-4. Разделенные в акрилалп дном геле до индивидуальных белковых полос антигены ВИЧ переносят методом электропереноса на нитроцеллюлозный фильтр, вирусные антигены Идентифицируют и полосы нитроцеллк1лозных фильтров, соответствующие бcJIKaM р24, р55, др 4 1. др 120, вырезают и фрагменты этих полос монтируют нитроцеллюлозным клеем на специальную бумажную пл.1стинку, формируя диагностическую

ii,.;ûcêó. Активную часть диагностичсс;ой йолоски, представляющую собой фрагмента нитроцеллюлозных фильтров каждый из которых паcp. r i .a своей поверхности один белок ВИЧ: р24, р55, др 41, др 120, погружают в анализируемую сыворотку, разведенную 1:50 физиологическим раствором. После инкубации диагностическую полоску проявляют с использованием антивидового

I коньюгата, аналогично иммунологическому проявлению способа-прототипа

Вестернблот. Для повышения достоверности результатов анализа при иммуноферментном определении используют два маркерных фермента — р -лактамазу из Bacillus licheniformis и перокспдаэ у хрена. века антител к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ).

Целью изобретения является увеличение чувствительности и упрощение способа определения антител к ВИЧ.

1597728

Способ осуществляют следующим образом.

Проводят эМектрофорез вируссодержащего материала (экстрактов вируспродуцирующих клеток лимфоблостоидной

5 линии НТА-4) в акриламидном градиентном 4-20Х-ном геле с детергентом.

Осуществляют электроперенос белков на нитроцеллюлозную мембрану, идентифицируют их, монтируют диагностическую полоску, проводят взаимодействие с исследуемой пробой, а связавшиеся специфические антитела выявляют, используя параллельно два маркер- 1> ных фермента: р-лактамазу из Bacillus licheniformis 749/С и перексидазу хрена.

Пример 1. 1.1. Получение экстракта белков ВИЧ из вирус-продуцирующих клеток.

1 л культуры вирус †продуцирующ клеток (лимфоблостоидная линия

НТА-4) центрифугируют при 2000g,.

30 мин при охлаждении. Осадок, содержащий вирус-продуцирующие .клетки, используют для получения экстракта.

При использовании только очищенного .вирусного препарата из 1 л вируспродуцирующей культуры можно получить до 3500 диагностических доз (при проведении определения методом твердофазного иммуноферментного анализа). Возможность использования осадка для получения антигенов ИВИЧ позволяет получить дополнительно еще до 1500 доэ (при проведении определения предлагаемым способом), т.е. выход увеличивается на 30 ..

Таким образом, возможность использования осадка повышает экономичность метода.

Осадок суспендируют в 0,9 -ном . растворе NaC1 в 0,1 M Na-фосфатном, буфере (ЗФР)„ рН 7,0. Медленно, при перемешивании, добавляют равный объем 9б -ного этилового спирта к суспензии вирус-продуцирующих клеток в ЗФР. Операцию проводят при охлаждении, температура суспензии не должна быть выше 10 С. Смесь отстаива-50 ют .30 мин при комнатной температуре, а затем центрифугируют при 2000g

30 мин. Осадок собирают, гомогенизируют 15 мин в стеклянном гомогенизаторе в 0,2% .ном растворе дезоксихола- 55 та, а затем добавляют н-октилглюкозида до концентрапии 0,4 и снова гомо генизируют 15 мин, посйе чего остав-, ляют смесь на 1 ч при постоянном перемешивании. Смесь центрифугируют при

20000g 1 ч. Осадок отбрасывают, супернатант диализуют против ЗФР 18 ч. После диализа полученный экстракт вируспродуцирующих клеток замораживают и хранят при -20 С или лиофилизируют и о о хранят нри 4 С.

1.2. Проведение электрофореза белков ВИЧ,, полученных из экстракта вирус-продуцирующих клеток в акриламидном геле. Электрофорез проводят в геле толщиной 1,5 мм, pasMepoM 160 х х 160 мм с использованием 4Х-ного концентрирующего акриламидного геля, рН 6,8 и градиентного 4-20Х-ного разделяющего геля, рН 8,8. Оба геля содержат додецилсульфат Na(SDS) 0,1 ;

Приготовление растворов для проведения электрофореза.

Электродный буфер: 45 r триса, 216 г глицина, 15 г SDS, 3 л воды, рН 8,3. Перед проведением электрофореза электродный буфер разводят водой 1:5.

Концентрирующий гель: 6,1 мл воды, 2,5 мп 0,5 М трис-НС1 буфера рН 6,8, 100 мкл 10Х-ного SDS 1,3 мл акриламида из ЗОХ-ного раствора акриламида, содержащего 0,8 бисакриламида.

50 мкл 10 .-ного свежеприготовленного персульфата аммония, 10 мкл ТЕМЕД (N,N,N,N-тетраметилэтилендиамин).

4Х-ный разделяющий гель: 10,22 мл воды, 4,25 мл 1,5 M три-НС1 буфера рН ,8,8 0,17 мл 10Х-ного SDS, 2,3 мл

30 -ного акрипамида, содержащего

0,8Х бисакриламида, 0,085 мл 10Х-ного персульфата аммония, 8,5 мкл ТЕМЕД.

20 .-ный радзделяющий гель: 1 мл воды, 3,75 мл 1,5 М трис-НС1 буфера, рН 8,8, 0,15 мл 10 -ного SDS, 10мл

30 -ного акриламида, содержащего

0,8Х бисакриламида, 75 мкл 10Х-ного персульфата аммония, 7,5 мкл ТЕМЕД.

Раствор для образцов, 4 мл воды, 1 мл 0,5 М трис-НС1 буфера рН 6,8, 0,8 мл глицерина, 1,6 мл 10 -ного

SDS, 0,4 мл 2- р меркаптоэтанола, 0,2 мл 0,05 -ного бромфенолового синего. Исследуемое вещество растворяют в растворе для образцов и прогревают 5 мин на кипящей водяной бане.

Заливка градиентного геля °

В первый сосуд прибора для градиентной заливки геля помещают приготовленный раствор 20Х-ного акрилами5 . t5 ного геля, во второй сосуд номе»пают раствор 4Х-ного акриламидного геля.

Заливку осуществляют так, чтобы высота градиентного геля составила не менее 120 мм.

Заливка концентрирующего геля.

После заливки концентрирующего геля до полимеризации геля в раствор помещают гре» евку" для электрофоре— за. После полимеризации геля "гре.бенку" удаляют.

Планшет с заполимеризованным акриламидным гепем помещают в прибор для электрофореза фирмы "Bio-Rad"

"Protean//"Slab Cell или. в любой аналогичный прибор для проведения вертикального электрофореза в пластинах.

»

Образец экстракта вирус-продуци— рующих клеток помещают в раствор для образцов и проводят операции согласно и. 1.2. На 160 мм ширины геля необходимо нанести не более 1,6 мг белка экстракта вирус-продуцирующих клеток. Кроме экстракта вируспродуцируюших клеток на одну из дорожек наносят смесь маркерных белков различной молекулярной массы.

Режим проведения электрофореза.

25 мА на гель для прохождения концентрирующего геля. 7-8 мА на гель для прохождения разделяющего геля. Общее время проведения элект-, рофореза 20 ч.

1.3. Проведение электропереноса белков ВИЧ, полученных из экстракта вирус-продуцирующих клеток на нитроцеллюлозный фильтр.

Буфер для проведения электропере— носа:

7,57 .r тTр иHсoаa, 36 г глицирина, 0,5 л 96Х-ного этилового спирта, воды до суммарного объема 2,5 л, рН 8,3.

Нитроцеллюлозный фильтр, вымоченный в буфере для электропереноса, накладывают на акриламидный гель, в котором проведен электрофорез белков экстракта вирус-продуцирующих клеток. На нитроцеллюлозный фильтр и на обратную сторону акриламидного геля накладывают прокладки из фильт— ровальной бумаги, смоченные буфером для электропереноса. Полученный блок акриламидный. гель — нитроцеллюлозный фильтр — прокладки помещают в прибор для электропереноса, заполненный буфером для электропереноса.

97728 6

Электроперенос осуществляется при напряжении 100 В 2 ч при охлаждении прибора.

1.4. Идентификация белков ВИЧ на нитроцеллюлозном фильтре.

Для определения места расположения маркерных белков различных молекулярных масс после электропереноса белков нитроцеллюлозный фильтр ок-рашивают 30 мин 1Х-ным раствором амидочерного, а затем отмывают избыток красителя ЗФР с 0,05Х Твин-20 (ЗФР-Т).

С целью точного определения мест расположения белков ВИЧ различной молекулярной массы, строят калибровочный график зависимости lg молекулярной массы от длины пробега белков на

20 электрофорезе. Перед иммуноферментной индентификацией нитроцеллюлозный фильтр инкубируют в 1Х-ном растворе бычьего сывороточного альбумина 1 ч для инактивации оставшихся свободны25 ми центров связывания белков на нитрацеллюлозе. С двух противоположных сторон нитроцеллюлозного фильтра вдоль направления электрофореза отрезают две полоски шириной 2-3 мм

30 и помещают их на 1 ч в разведенную

1:100 ЗФР-Т с 1Х-ным бычьим сывороточным альбумином пуллированную человеческую сыворотку, содержащую антитела ко всем белкам ВИЧ. Полоски от-. мывают ЗФР-Т 3 раза по 2-3 мин, затем отмывают 5 раз водой. Полоски помещают в раствор конъюгата кроли-. чьих антител к иммуноглобулинам человека (RAH) с пероксидазой хрена

40 .на 1 ч. Проводят отмывку в ЗФР-Т

3 раза и затем водой.

Полоски помещают в раствор субстрата для пероксидазы: 0,05Х-ный раствор диаминобензидина, который содер45 жит .10 мкл Н О íà 100 мл раствора.

Через -2-5 мин инкубации, в тех местах, где локализованы белки ВИЧ, появляются полосы кирпично-красного цвета.

50 1.5. Монтаж диагностической полоски. После определения локализации белков ВИЧ иммуноферментным методом и по молекулярным массам из пластин нитроцеллюлозного фильтра вырезают полоски, соответствующие белкам gp120, gp4 1, р55, р24, так, чтобы место расположения белка на нитроцеллюлозе

1597728

Диагностическую полоску, инкубировавшуюся в конъюгате, меченном лактамазой, помещают в 2 мл иодного реагента — раствор иодинола, разведенный ЗФР в соотношении 1:3, содержащий 0,1 мг/мл бензилпенициллина. Если в испытуемой сыворотке присутствуют антитела к белкам ВИЧ, то синий иодный реэгент обесцвечивается, если

S0 находилось посредине вырезанной полоски, На специальную бумажную ручку с нанесением на нее цифрами 1,2,3,4 нитроцеллюлозным клеем монтируются фрагменты нитроцеллюлозных фильтров, содержащие белки ВИЧ, так, что напротив цифры 1 находится белок gp 120, 2-gp4 1.

З-р55, 4-р24. Размеры фрагментов

845 мм.

Для придания ручке механической жесткости она заклеивается прозрачной липкой лентой, при этом фрагменты нитроцеллюлозных фильтров остают°,5 ся свободными (их размеры 5Х5 мм) и образуют активную часть диагностической полоски.

1.6. Использование диагностической полоски.

Активную часть диагностической полоски погружают в раствор исследуемой сыворотки, разведенной в соотношении 1:100 ЗФР-Т на 40 мин. В каждую из испытуемых сывороток погружа- 25 ют две диагностические полоски.

Диагностическую полоску отмывают

3 раза ЗФР-Т и водой 5 раз. По одной диагностической полоске, проинкубированной в каждой из испытуемых сыво- 30 роток, помещают в конъюгат RAH, меченный пероксидазой хрена, а по од-. ной — в конъюгат ВАН, меченный р-лактамазой из Bacillus licheniformis

749/С. С обоими конъюгатами инкубацию проводят 40 мин.

Повторяют отмывку.

Диагностическую полоску, инкубировавшуюся в конъюгате кроличьих антител против глобулинов человека 40 (КАГ), меченном пероксидазой, помещают в раствор диаминобензидина. Если в испытуемой сыворотке присутствуют антитела к белкам ВИЧ, то на активной части диагностической полоски 45 появятся кирпично-красные полосы, ес-ли антитела к белкам ВИЧ отсутству-. ют — активная часть останется неок. рашенной. антитела к белкам ВИЧ отсутствуют реагент остается синим.

П р и и е р 2. Дифференцирование положительной, т.е. содержащей антитела к белкам вируса ВИЧ, "слабоположительнои", т.е. содержащей минимальное количество антител, и ипсевдоположительной сывороток при помощи диагностических полосок.

2.1. Проведение всех операций согласно примеру 1 до инкубации о

КАГ включительно, 2.2. Диагностическую полоску, инкубировавшуюся в конъюгатЕ КЛГ, меченном лактамазой, помещают в пробирку, содержащую 1 мл иодинола, разве— денного 1:3 ЗФР и содержащего 0,1 м| бензилпенициллина на 1 мл. Синяя окраска раствора исчезает, если в исследуемой сыворотке содержались антитела к белкам ВИЧ.

2.3. "Положительной" можно считать такую сыворотку, которая при проведении операции, описанной в и. 1,6, дает окрашенные полосы на активной части диагностической полоски, при проведении операции п. 1.6 раствор пенициллина в иодиноле обесцвечивается.

2.4. "Слабоположительнои" можно считать сыворотку, дающую положительный ответ только с конъюгатом КАГ, меченным р-лактамазой.

В случае "слабоположительной" сыворотки при использовании пероксидазного конъюгата вследствие незначительного количества присутствующих в ней антител к белкам ВИЧ может не наблюдаться видимых визуально полос на фрагментах нитроцеллюлозного фильт— ра (или эти полосы могут быть видны слабо), однако при использовании -лактамазы в качестве маркера суммируется ферментативная активность молекул иммуноферментного конъюгата, специфически сербированных на фрагментах нитроцеллюлозного фильтра, составляющих диагностическую полоску, что в совокупности с более высокой удельной активностью / -лактамазы позволяет отличать "слабоположительные" сыворотки от "отрицательных".

B .этом случае можно установить только факт наличия антител .и невозможно установить, к каким именно белкам

ВИЧ имеются антитела.

2.5. "Псевдоположительной" можно считать сыворотку, которая при пр»ведении- операции 1,6. дает окрашевФормула изобретения

Составитель Н ° Калинин

Техред М.Дидык Корректор О.Кравцова

Редактор А.Шандор

Заказ 3049 Тираж 518 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óêãoðoä, ул. Гагарина,101,9 ную полосу, соответствующую белку р24, также дающую "положительный" ответ, Применение двух маркерных ферментов, различных по своей удельной активности (p-лактамаза из Baci14.

licheniformis 749/С превосходит пероксидазу хрена по удельной активности — "числу оборотов" в 100 раз) позволяет выявить "слабоположительные" сыворотки и различать "псевдоположительные", т.е ° имеющие антитела только к р24, от "положительных", т.е. имеющих антитела к нескольким белкам ВИЧ.

Таким образом, предлагаемый способ дает возможность увеличить чувствительность определения, упростить интерпретацию результатов и повысить их достоверность. Кроме того, предлагаемый способ более экономичен, чем прототип.

Способ определения антител к вирусу иммунодефицита человека в крови при помощи иммуноферментного метода с ис97728 пользованием маркерных белков вируса иммунодефицита человека, получаемых иэ вируссодержащего материала методом электрофореза в акриламидном геле, электропереноса их на нитроцеллюлозную мембрану с последующей идентификацией, добавлением исследуемой пробы, выявлением специфических антител конъюгатом кроличьих иммуноглобулинов против иммуноглобулинов человека с пероксидазой хрена, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повьппения чувствительности и упрощения способа, в качестве вируссодержащего материала используют экстракт вируспродуцирующих клеток, электрофореэ проводят в градиентном акриламидном геле, идентификацию белков вируса

20 иммунодефицита человека осуществляют

:путем монтирования фрагментов 1 нитроцеллюлозной мембраны с маркерными белками в диагностическую полоску, а для выявления специфических антител дополнительно добавляют конъюгаты кроличьих иммуноглобулинов против иммуноглобулинов человека с

/ -лактамазой иэ Bacillus licheniformis 749/С.