Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus l. продуцент моноклональных антител к инсулину

 

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для индикации и аффинной очистки инсулина человека. Цель изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток животных MUS MUSCULUS, продуцирующих моноклональные антитела (мон АТ) к инсулину, способные в одинаковой степени хорошо взаимодействовать как с инсулином свиньи, так и с инсулином человека. Штамм получают гибридизацией клеток мышиной миеломы линии SP 2/0 с клетками селезенки мышей линии BALB /C, иммунизированных монопиковым инсулином свиньи. Штамм депонирован в ВСКК(II) N 257Д. Клетки культивируют в среде ДМЕМ, содержащей 10 % фетальной сыворотки, 3,5 мм глюматина, 17,5 мкМ пирувата натрия, 50 мкМ 2-меркаптоэтанола

посевная доза 25000 клеток/мл, пассирование 1 раз в 5-6 дней. Штамм продуцирует специфичные к инсулину монАТ класса IGG 1 и имеет аффинную константу К 1х10 1° М -1. Гибридома стабильно продуцирует монАТ в течение 8-10 пассажей, и концентрация монАТ в асцитной жидкости составляет 12-13 мг/мл.

. СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН (19) (11) А1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И OTHPbITHAM

ПРИ П(НТ СССР

1 . (21) 4486022/31-13 (22) 23,09. 88 (46) 30.09.90. Бюл. № 36 (71) Институт биохимии им. А.Н.Баха . и МГУ им. М.В.Ломоносова (72) Т.B.Чередникова, М,В.Демчева, А.M.Åãîðîâ и Е.И.Гаврилова (53) 578.085.23 (088.8) (56) Rat)en D.A.,Underwood Р.А.

Identification of artigenic determinates on insulin, recognized Ьу monoclonal antibodies, M0L. Immunol.,1983, v. 13, 693-700. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUG М(1Ж(ПЛЯ ., ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К

ИНСУЛИНУ (57) Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для индикации и аффинной очистки инсулина человека. Цель изобретения получение штамма гибридных культивируИзобретение относится к гибридной технологии и может быть использовано дЛя индикации и аффинной очистки инсулинаа ч ело в ек а, Ф

Цель изобретения — получение штам" ма гибридных культивируемых клеток животных Мцз mus culus продуцирующих моноклональные антитела к инсулину., способные в одинаковой степени хорошо взаимодействовать как с инсулином свиньи, так и с инсулином человека.

Штамм получают следующим образом.

4-недельных мышей линии EhLb/ñ иммунизируют монопиковым инсулином свиньи в течение 1 мес 3 раза 30 мкг ин(51)5 С 12 М 5/00, А 61 К 39/395

2 емых клеток животных Mus musculus, продуцирующих моноклональные антитела (монАТ ) к инсулину, способные в одинаковой степени хорошо взаимодействовать г как с инсулином свиньи, так и с инсулином человека, Штамм получают ги.бридизацией клеток ььппинои ьыелоьы линии

Sp 2/О с клетками селезенки мьппей линии 3aLb/с, иммунизированных монопи. ковым инсулином свиньи. Штамм депонирован в BCKK(II) ¹ 257D, Клети культи вируют в среде ДМЕМ, содержащей 10% фетальной сыворотки, 3>5 мМ глютамина, 17,5 мкМ пирувата натрия, 50 мкМ

2-меркаптоэтанола; посевная доза . 25000 клеток/мп, пассивирование 1 раз в

5-6 дней. Штамм продуцирует специфичные к инсулину монАТ класса 1gGI и

0 имеет аффинную константу К 1

Гибридома стабильно продуцирует монАТ в течение.8-10 пассажей, и концентрация монАТ в асцитной жидкости составляет 12-13 мг/мл. сулина. При первой инъекции раствор инсулина суспендируют в равном объеме адьюванч а Фреинда, последующие инъекции проводят без него. Титр антител. в сыворотке крови животных, определяемый методом ELISA> составляет 1:

:15000. За 4 дня до слияния яппей иммунизируют .раствором инсулина в физио- фВ логическом растворе. Через 4 дня у маши извлекают селезенку в стерильных условиях, гомогею зируют в физиологическом растворе, содержащем 107.-ную глюкозу, и оставляют стоять 3 мин. . Грубый осадок отбрасывают, а взвесь клеток переносят в центрифужный ста1 i 9 5903 4 кап и центрифугируют 8 мин при 8008

Надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок суспендируют в 50 мл физиологического раствора, содержащего глюкозу, снова центрифугируют в тех же условиях. Эту опер ацию повторяют 2 раз а.

Аналогичным образом промывают Зраза физиологическим раствором миеломные клет-ки мыши линии Sp 2/0. После этого селез е.ночные клетки смешивают с миеломными в ,,соотношении 10: 1 и осаждают их центри- фугиров ани ем ° Надос адочную жидкость слИвают и к осадку медленно по каплям добавляют 1 мл 50 -ного полиэтиленгликойя в физиологическом растворе, содержащего 10Х диметилсульфоксида, Через 3 мин медленно в течение 5 мин добавляют физраствор, содержащий глюкозу, до объема 50 мл, клетки осаждают центрифугированием и осадок суспен|дируют в среде Лгла, модифицированной

Дульбекко (ДМЕМ), содержащей 10 фетальной сыворотки крупного рогатого скота; 3,5 мМ глютамина; 17,5 мкМ пи- 25 рувата натрия; 50 мкМ 2-меркаптоэтанола; 100 мкМ гипоксантина; 16 мкМ тимидина и 0,4 мкМ аминоптерина. Клетки распределяют в пяти 96-луночных микропланшетах и культивируют в СО,инкубаторе при 37 С в атмосфере 5Х

СО ..Через 5 дней клетки подкармливают, Через 2 нед после начала слияния проводят тестирование гибридом ца наличие монАТ методом ELISA. Клетки,, положительные по результатам тестиро- 35 вания, помещают в среду, содержащую все указанные компоненты, за исключением аминоптерииа (НГ-средa), Клетки нар ащив ают в 24-луночных микропл аншетах и клонируют в полужидком агаре, 40

Клонирование гибрид ами повторяют 3 раза. Гибридому 5Н, 1В, 10Б перевивают на мьппах HBLb/ñ для получения асцит— ной жидкости.

Штамм гибридомы, синтезирующий ион

AT к инсулину, депонирован под номером ВСКК(П) N - 257D и характеризуется следующими признаками.

Культур альные свойства, Для выращивания штамма используют культуральные флаконы. Во флакон объемом 25 мл в 3 мл среды ДИЕМ, содержащей 10 фетальной сыворотки, 3,5 мМ глютамина; 17 „6 мкМ пирувата натрия, 50 MKN 2-меркаптоэтанола, засевают

250000 клеток гибридомы 5Н, 18, 10В и про.водят пассажи 1 раэ в 4-5 дней с подсчетом клеток. Для получения асцита мышам BaLb/с за 7 дней до введения гибридомных клеток вводят 0 5 мп .2, 6, 10, 14-тетраметилпента †дека в/бр. На седьмой день штамм клеток инъецируют в/бр в количестве 500 тыс. клеток намьгль, Аецитную жидкость отбирают на 12-14-й день. Объем асцита составляет 5-6 мл. Клетки из асцита перевивают мышам в течение 8-10 пассажей без заметного изменения титра монАТ в асцитной жидкости.

Характеристика полеэ.ного продукта.

МонАТ относится к ?ЕС1 подклассу и имеет аффинную константу I=10 M

Кариологическая характеристика, штамма. Модельное число хромосом 80, маркерные хромосомы не выявлены, Продуктивность штамма, Концентрация моноклональных антител в культуральной жидкости на седьмой день культивирования составляет 100 мкг/мл, а в асцитной жидкости 10- 12 мг/мл при определении по методу Лоури и в Е1Л$А, Криоконсервирование, Клетки штамма ресуспендируют в смеси, содержащей

10Х ДМСО, ЗОХ фетальной сыворотки и

60 . -среды ДМЕМ, в концентрации 1 10 клеток на 1 мл, разливают при 4 С в пластиковые ампулы, помещают в полиуретановые контейнеры и переносят в холодильник на -70 С на 18 ч. Затем клетки переносят в жидкий азот на длительное хранение. Размораживание производится при 37 С в водяной бане.

Жизнеспособность клеток оценивается с помощью трипанового синего и составляет 40, Концентрация. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительг ном наблюдении. Тест на микоплазму отрицателен.

Пример. Моноклонапьные антитела используют для определения концентр ации и н сули н а мет одом и мму ноф ер ме нтного анализа. В 96-луночные полнстироловые планшеты для микротитрования помещают 100 мкл (10 мкг/мл) раствора монокпональных антител в О, 1 M карбонатном буфере (рН 9,0) и инкубируют в течение 2 ч, Затем в каждую лунку микропланшета помещают О, l -ный бычий сывороточный альбумин (БСА) в том же буфере и инкубируют 2 ч. Лунки микропланшета промывают 0,015 М фосфатным буфером (рН 7,4),. содержанкам

0,15 М NaCI и 0,05Х твин-20 (4>HT) ° К адсорбированным на полистирале моно- клональным антителам добавляют 100 мкл

5 1595903 раствора, содержащего исследуемый образец инсулина.и коньюгат инсулина с ковалентно пришитой к нему пероксидазой в ФБТ. В контрольные лунки по-мещают такой же образец, но не содержащий инсулин. Инкубируют 1 ч при

37 С. Промывают ФБТ и добавляют в каждую лунку субстратную смесь: 0,03%

Н 0; 2 мМ АВТ (2.2-азино- -этилбен- 1р эотиозолин-(6)-сульфоновой кислоты;

0,05 М цитратный буфер, р3 4,0. Оптическую плотность считывают при 412 нм на автоматическом считывающем устройстве., Концентрацию инсулина вычисляют по построенной в параллельном эксперименте калибровочной кривой, полученной в аналогичных условиях, однако в лунки микропланшета помещают извест- ные концентрации инсулина, 20

Чувствительность определения инсу.лина этим методом составляет 100 пкг гормона/мп °

Специфичность взаимодействия моноклональных антител с инсулином оценивают методом, конкурентного иммуноферментного анализа в следующей системе . моноклональным антителам, адсорбированным на полистироле, добавляют инсулин свиньи, меченый пероксидазой, а 30 также немеченый инсулин свиньи, быка, человека или же изолированные А- и Вцепи инсулина. Степень взаимодействия моноклональных антител с инсулинаьы иэ других источников, а также А- и В" цепяьм оценивают по проценту ингибирования связывания коньюгата инсулинпероксидаза по сравнению со связыванием в присутствии инсулина свиньи в качестве конкурирующего агента.

Моноклональные антитела 5Н I В, IОВ одинаково взаимодействуют с инсулином человека и свиньи, однако для ингибирования связывания конЬюгата .инсулин свиньи-пероксидаза на 50Х требуются в 10 раз более высокие кон: центрации инсулина быка чем немече1

Ъ ного инсулина свиньи. Таким образом, моноклональные антитела к инсулину свиньи могут быть использованы для количественного определения инсулина человека, Они оказываются пригодныьи также для аффинной очистки генно-инженерного инсулина человека. На колонке на основе ВАСЯ активированной агарозы, с которой связано 6 -!О М моноклональных антител, можно получить более чем 7 М инсулина.

Формул а из о6р ет ения

3ТВММ гибридных культивируемых клеток животных #из musculus L.

BCKK(II) ¹ 256D — продуцент моноклонапьных антител к инсулину../

Составитепь А.Маныкин

Техрец М.Дидык . Корректор Л,Пилипенко

Редактор M,Ïåòðîâà

Заказ 2889

Тираж 499

Подпи с но е

ВНИИПИ Госчдарственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101