Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus - продуцент гемопоэтического ростового фактора

 

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано при разработке методов лечения болезней крови. Цель изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток животных MUS MUSCULUS L, продуцирующих гемопоэтический (колониестимулирующий) ростовой фактор. Штамм получают гибридизацией стимулированных тимоцитов и клеток сингенной тиомы В 5147 при помощи 50%-ного раствора ПЭГ (мол.мас.4000). Штамм получил условное обозначение МК1 и депонирован в ВСКК (П) N 232Д. Клетки культивируют в среде 1МДМ с 10%-ной эмбриональной телячьей сывороткой, 2 .10 -4М Г-глутамина, 0,05*099.10 - 4 меркаптоэтанола, 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина при 37°С в атмосфере 5% CO 2. Посевная доза 100-200 тыс.клеток на 1 мл. Продукция штамма через 48 ч культивирования в 10-12 раз превышает таковую собранного через 120 ч культивирования супернатанта мышиных спленоцитов, стимулированных конкавалином А (эталонный образец). Продукция гемопоэтического ростового фактора мыши сохранятся до 60-ти пассажей IN VITRO. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСИбму сВиДЕТЕЛьСтВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

IlO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И OTHPblTHRM

ПРИ ГННТ СССР

1 (21) 4484014/30-13 (22) 19.09,88 (46) 15,08.90, Бюл. ¹ 30 (71) Белорусский научно-исследовательский институт переливания крови (72) Л.В.Карканица и А.В.Панютич (53) 578.085.23(088.8) (56) Schrader Т.W. I. Clark.-Lewis

В.ArnnoÛ . - Nature, 1980, 283. рр. 1 97-1 98, 1 (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ МПЯ MUSCULUS L — ПРОДУЦЕНТ ГЕМОПОЭТИЧЕСКОГО РОСТОВОГО

ФАКТОРА (57) Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано при разработке методов лечения болезней крови. Цель изобре1 ,тения — получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Маа

alusculus L продуцирующих гемопоэтический (колониестимулирующий) ростоИзобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано при разработке методов лечения болезней крови.

Цель изобретения — получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L, про-. дуцирующих гемопоэтический (колониестимулирующий) ростовой фактор (КСФ).

Штамм получают следующим .образом.

Тимоциты мышей линии AKI ресуспен1дируют после выделения и отмывок в

„.SU„„1 85330 А1

И1)5 С 12 N 0 А 61 К 39/395

2 вой фактор. Штамм получают гибридизация." стимулированных тимоцитов и кле-.с>: ",.ингенной тиомы В 5147 при помощи 50%-ного раствора ПЭГ (мол. мас. 4000). Штамм получил условное обозначение МК1 и депонирован в ВСКК (II) № 232Д. Клетки культивируют в среде 1МДМ с 10Х-ной эмбриональной телячьей сывороткой, 2 х! 0 М Ь-глутамина, О, 05 х1 0 < ме ркаптоэтанола, 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина при о

37 С в атмосфере 5% СО „Посевная доза 100-200 тыс. клеток на l мл.

Продукция штамма через 48 ч культивирования в 10-12 раз превьппает таковую собранного через 120 ч культивирования супернйтанта мьппиных спленоцитов, стимулированных конкавалином А (эталонный образец). Про- С, дукция гемопоэтического ростового фактора мыши сохраняется до 60-ти пассажей in vitro. 2 табл. среде ТМДМ в концентрации 2 млн/мл.

Среда включает также 5% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 2 мМ

L-глютамина, 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина, 0,05 мМ меркаптоэтанола, 5 мкг/мл конвалина А. !

Клетки тимомы ВМ5147 культивируют в этой же среде беэ добавления конканавалина А. Через 48 ч после начала стимуляции тимоцитов конканавали" ном А проводят гибридизацию 2х10 стимулированных тимоцитов и 2 10

7, клеток сингенной тимомы в 5147 при . помощи SOX-ного раствора полиэтилен1585330 гликоля мол. массы 4000 в течение

1 5 мин. После гибридизации и отмывки клеток от полиэтилегликоля клетки высевают в 96-луночные платы по

l,xI0 в лунку. Для культивирования

5 и селекции гибридом используют среду

?МДИ добавлением 10Х ЭТС, 10 " М гипоксантина, 4 «10 М аминоптерина, 1,6ч.10 М тимидина, а также 1 -глютамин, меркаптоэтаиол, смесь антибиотиков. Гибридомы после наращивания к ультивируют в среде ХМДМ с 10% ЭТС, Ь-глютамином, меркаптоэтанолом, смесью антибиотиков. Супернатант культур гибридных клеток тестируют на содержание КСФ в полутвердых агаровых культурах костномозговых клеток-предшественниц кроветворения мышии. Все полученные гибридомы (количеством 4) спонтанно продуцируют в культуральную жидкость гемопоэтический ростовой фактор, стимулировавший образование колоний гранулоцитов и макрофагов в данном тесте. Одни иэ.исходных гибри- 5 дом колонировали методом конечных раэведеьгий, высевая по.1 клетке в

0,2 мл питательной среды йа лунку, содержащую 4к10 сингекных спленоцитов. В результате получен штамм гибридных клеток,.продуцировавший, как и исходная гибридома, гемопоэтический (колониестимулирующий) фактор мыши.

Штамм получил условное обозначение

МКХ и депонирован под номером ВСКК (II) У 232 D.

Штамм характеризуется следующими свойствами.

Культуральные признаки.

Стандартные условия культивирования. Среда ?МДМ с 10% эмбриональной телячьей сыворотки 2 х1 О М

L-глутамина, 0,05х10 меркаптоэтано— ла, I ÎOìêã/ìë пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, при 37 С и в атмосфере 5Х СОг.

Для выращивания штамма используют стеклянную посуду, посевная доза

1 00-200 тыс. кл./мл. Культура монослойная, для диссоциации клеточного монослоя испольэовали подогретый до

37 С раствор трипсина-версена. Среду культивировали один раз в два-три дня °

Продуктивность штамма.

Гемопоэтнческая (колониестимулиру— ющая) активность собранного через

48 ч культивирования штамма в 10-12 раз превышает таковую собранного через 120 ч культивирования ауцернатанта NbwHHboc спленоцитов, стиЫулированных конкан&валнном А (эталонный образец).

Характеристика полученного продуктаа.

Штамм продуцирует мышиный гемопоэтический ростовой фактор, стимулирующий колониеобраэование в мышиных агаровых культурах кроветворных клеток-предшественниц, выделенных из костного мозга. Специфичность ростового фактора не определена.

Методы оценки сохранения продукции: тест колониеобраэования в агаро. вых культурах мышиных костномозговых клеток-предшественниц кроветворения.

Костномозговые клетки-предшествен— йицы кроветворения мыши очищают от макрофагов инкубацией на пластике (37 С, 1,5 ч). Колониеобразование исследуют в 24-луночных платах "Nunc" в О,б мл культуральной среды, содержащей 0,3% агар, среду ТМДМ, 20Х эмбриональной телячьей сыворотки и

12,5% супернатанта клеток штамма.

Контролем служат культуры кроветворных клеток-предшественниц, не содержащие супернатант (отсутствие колониеобразования).

Стабильность продукции.

Продукция гемопоэтического рос,ового фактора мыши сохраняется как минимум до 60-ти пассажей in vitro.

Криоконсервирование.

Для длительного хранения клетки штамма эамораживают в эмбриональной телячьей сыворотке с добавлением 10Х диметилсульфоксида. Режим замораживания: 1 С/мин до -70 С. После замораживания клетки переносят в жидкий азот. Размораживание на водяной бане при 37 С. Жизнеспособность клеток после размораживания 60-70% по ок" рашиванию трипановьм синим.

Контаминация, Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Зара жение микоплазмой не выявлено при. окрашивании красителями на ДНК и по характеру включения тимидиновой метки.

Использование штамма иллюстрирует ся следующими примерами.

Пример 1. Продукция гибридньгми клетками MKI гемопоэтического

1 585

330 6 (5 мкг/мл) тимоцнтамн мьппей линий

AKR; клетки культивируют 48 ч í среде ?МДМ с 10% 3ТС, Ь-глютамином, меркатоэтанолом, смесью антибиотиков, после чего собранные супернатанты тестируют на содержание ХСФ. Результаты этого примера свидетельствуют о специфической спонтанной продукции -клетками предлагаемого штамма гемопоэтического (колониестнмулирующего) ростового фактора мьппи, Пример 2. Влияние рекомби-нантного фактора некроза опухолей-Ф человека на синтез КСФ гибридными клетками предлагаемого штамма MKI.

Гибридные клетки предлагаемого штамма ресуспендируют в среде ХМДМ, содержащей IX ЭТС, L-глютамин, меркаптоэтанол, смесь антибиотиков (концентрации указаны выше). Концент— рация клеток 1 млн/мл. Исследования проводят в 24-луночных платах, конечный объем культуры 1 мл на лунку, В культуры добавляют разные количества рекомбинантного фактора некроза опухолей-4 человека — невидоспецифического монокина. Активность рФНО- a(определяют в цитотоксическом тесте на 1929-клетках. Для доказательства специфического влияния рФНО-o(на продукцию КСФ гибридными клетками в параллельных культурах активность рФНО-c(нейтрализуют специфическими моноклоналъными антителами.

Результаты этого опыта представлены в табл. 2.

Они свидетельствуют о том, что продукция КСФ гибридными клетками штамма прекращается при снижении концентрации ЭТС до IX. На этом фоне воздействие на гибридные клетки рФНО-о приводит к восстановлению продукции КСФ. При этом наблюдают дозозависимое от рФНО- (увеличение продукции КСФ.

Таким образом, гибридные клетки предлагаемого штамма MKI могут служить моделью для изучения регуляции синтеза КСФ другими лимфокинами и/или монокинами, 5 (колониестимулирующего) ростового

I фактора мьппи.

Гибридные клетки помещают в стеклянный флакон объемом 50 мл по . Ix)0 кл./мл в 5 мл питательной сре". б ды ХМДМ с I OX 3TC, 2 мМ?,"глютамина, по 1 00 мкг/мл пенициллина и с трептомицина, 0,05 MM меркаптоэтанола.

Клетки культивируют 2-3 дня при 37 С в атмосфере 5% СО, Полученный супере натант используют в качестве образца КСФ в культурах кроветворных клеток-предшественниц мыши.

Тест на определение биологической активности КСФ в супернатанте культуры гибридных клеток предлагаемого штамма.

Кос тномоэ говые клетки-п редшеств енницы кроветворения выделяют из бедренной кости мьппи линии C57BI и отмывают дважды в .реде 199 с 5% ЭТС, L-глютамином, меркаптоэтанолом и смесью антибиотиков. После отмывок клетки ресуспендируют в среде. ?МДМ, содержащей 10%. ЭТС и вьппеуказанные,добавки, и инкубируют на пластике (I,5 ч, 37 С, 5% СО ) для удаления макрофагов н исключения. тем самым эндогенного колониеобразования. Затем клетки отмывают и ресуспендируют в культуральной среде ХМДМ, содержащей 0,3% агар

Дифко, 20% ЭТС, L-глютамин, меркаптоэтанол и смесь антибиотиков. Пролифе рацию исследуют в 24-луночной плате 35

"Nunc" в присутствии исследуемых образцов. Объем культуры 0,64 мм на лунку, объем тестируемого образца или . его разделения 0,08 мл на лунку. В качестве контрольного образца КСФ с. 40 известной активностью используют су пернатант культуры спленоцитов мыши, стимулированных митогеном. На 1)-е сутки культивирования при 37 С, в атмосфере 5% СО .и 100Х влажности учи- 45 тывают колонии под инвертированным микроскопом. 3а колонию принимают клеточные агрегаты, содержащие ие менее 50 клеток.

Результаты опыта представлены в 50 .табл. 1.

Для доказательства специфичности продукции КСФ гибридньии клетками

MKI исследуют продукцию КСФ в культурах исходных клеток — тимомы ВМ5) 47 55 и стимулированными конканавалином А

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L.

BCKK(II) У 232D — продуцент гемопоэтического ростового фактора.

1585330

Таблица I

Разведение М «1 м образца (количество (конечное) колоний) 1:8

Супернатант культуры гибридных клеток NKI

80+1, б

63,7+2,0

1:16

Супернатант тимомы

ВИ5147 (48 ч инкубации) 0

1:8

1:16

1:8

1 16

Контрольный образец КСФ

1;8

1:16

1:32

Интактные культуры кроветворных предшественников (без КСФ) 0

"Варианты 4 и 5 характеризуют саму тест-систему, :Ю

Таблица 2

Н м тика первич бридных клет личес тво оний) 65,3+2,0

36,7+1,4

1:8

10Х ЭТС

1:16

1:8

1Х ЭТС

1 16

39 .0, 7

30,7+1,2

1:8

1:16

1:8

1:16

70,3+1,0

43,3+2,8

1-.8! 16 рФНО- а(IХ ЭТС, 100 ед/мл рФНО-о(, 1:200 антител

1:8

О

1:16

Вариант Тестируемый образец

Супернатант тимоцитов АКР, стимулированных конканавалином (48 ч инкубации) 1% ЭТС

1 ед/мл рФНО- 4

1% ЭТС, 1 ед/мл рФНО-о(1:200 антител

IХ ЭТС, 100 ед/мл

9,3+0,7

3,7+0,7

33,3+0,7

24 1,2

11+ 1,6

Продолжение табл.2 1S85330

13 3Tcу 11200 антител

1:8

1:16

6210,Э

38,75 4

10Х ЭТС, l:200 антител .

1:8

1;16

Контроли тест-системы1

Интактные культуры кроветворных предшественников

10 Контрольный образец КСФ

1:8

29,320,7

33,7 1,4

2I,3+0,7

1:16

1:32

1:64

11+0

П р i- м е ч а н и е. В опытах использованы моноклональные антитела против рФНО- ц(человека °

-.Продуцирующую гибридому ЗСГЙ пассировали in vivo и затем собирали асцитическую жидкость, отбирая образцы с высоким содержанием антител по цитотоксическому тесту на 1929-клетках.

Составитель А, Маныкин

ТехРед Л. СеРдюкова КоРРектоР О, Кравцова

Редактор Н. Киштулинец

Заказ 2304 Тираж 496 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101