Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus l, используемый для получения моноклональных антител к антигену сд38 кортикальных тимоцитов

 

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для определения иммунологического статуса организма. Цель изобретения - получение моноклональных антител, выявляющих новый эпитоп молекулы CD 38, сильно экспрессированный на мононуклеарных клетках крови и гранулоцитах. Штамм получают путем гибридизации клеток мышиной миеломы РЗ х 63 AG 8653 и клеток селезенки мышей линии BALB/C, иммунизированных Т-лимфоцитами человека и отбором клонов, продуцирующих монАТ. Штамм ИКО-45 депонирован под номером ВСКК(II) N 314D и продуцирует монАТ, относящиеся к IG 3 классу. Титр антител в культуральной жидкости 1:50, в асцитической жидкости 1:100000. МонАТ выявляют новый эпитоп антигена CD 38 с мол.м. 45 тыс. дальтон.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУ БЛИН (19) (И) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЬГГИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 445! 837/30-13 (22) 30. 06. 88 (46) 30,09.90. Бюл. Р 36 (71) Всесоюзный онкологический научный центр AMH СССР (72) А.Ю. Барьппников, Т. Н, Заботина, И,В.Дубинкин и З.Г.Кадагидзе (53) 578,085.23 (088.8) (56) Бюллетень экспериментапьной биологии и медицины, 1988, У.8.

Барышников A.Ю. и др. Моноклонапьные антитела ИКО-20 к антигену Т10 тимоцитов человека. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ.MUS MUSCULUS L, ИСПОЛЬЗУЕМЬЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К АНТИГЕНУ CD38 КОРТИКАЛЬНЫХ ТИМОЦИТОВ (57) Изобретение относится к гибриИзобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для определения иммунологическо го статуса ор ганиз ма.

Цель изобретения — получение моноклональных антител, выявляющих новый эпитоп молекулы CD38, сильно экспресcHpoBBHHblH на мононуклеарных клетках крови и гр анулоцит ах .

Штамм получают следующим образом.

Проводят соматическую гибридизацию клеток мышиной миеломы РЗ 63. Ag

8653 и клеток селезенки мышей лйнии

ВИ,В/с, иммунизированных Т-лимфоци- . тами человека, выделенные по методу

Е-розеткообразования. Проводят пять инъекций с интервалами в две нерели, Клетки в ноличестне 2 х10 вводят в . (д) С 12 И 5/00, А 61 K 39/395

2 домной технологии и может быть использовано для определения иммуноло- . гического статуса организма. Цель изобретения — получение моноклональных антител, выявляющих новый эпитоп молекулы CD38 сильно зкспрессированный на мононуклеарных клетках крови и гранулоцитах, Штамм получают путем гибридизации клеток мышиной миеломы

P3x63 Ag 8653 и клеток селезенки мышей линии BALB/c, иммунизированных Т-лимфоцитами человека и отбором клонов, продуцирующих монАТ. Штамм ИКО-45 депонирован под номером BCKK(II) Ф 314D и продуцирует монАТ, относящиеся к

Ig 3 классу. Титр антител в культурапьной жидкости 1:50, в асцитической жидкости l: 100000. МонАТ выявляют новый эпитоп антигена .CD 38 с мол.м.

45 тыс. дальтон. хвостовую вену мыши, На пятый день после последней иммунизации проводят слияние клеток селезенки мьппи и мышиной миеломы P3 63 Ag 8653. В стерильных условиях извлекают селезенку иммунизированной мыши и измельчают ножницами, а затем в гомогениза- Ьф торе Поттера. Взвесь клеток фильтруют .через два слоя марли. Лимфоциты дважды отмывают средой 199 и сливают с клетками миеломы в соотношении 10: l .

Смесь клеток отмывают один раз и помещают в объеме 20 мл среды 199 во флакон объемом 100 мп. В этом фпаконе клетки центрифугируют пфи

800 об/мин в течение 3 вини инкубируют

20 мин при 37 С ° Среду осторожно насухо отсасывают и к клеткам добавля1595902 ют 3 мп 50 -ного полизтиленгликоля с мол.м. 1500. Через 90 с во флакон вносят 20 мл среды 199. Клетки три раза отмывают, не встряхивая, и инкубируют при 37 С в течение 2 ч в 20 мп среды роста (DMEM), содержащей 20 телячьей эмбриональной сыворотки, t Ф

2 MM/мл глютамина.и 0,1 мг/мл гентамицина. Затем клетки разливают по

0,2 мл в лунки 96 — луночного плато.

На следующий день среду меняют на среду ГАТ (среда роста, содержащая

0)0136 мг/мп гипоксантина, 0,00091 мг/мл аминоптерина; 0,00385 мг/мл тимидина),15

Видимые колонии поя вляют ся на двенадцатый день в 95 из 96 лунок.

Скрининг проводят в непрямой реакции поверхностной иммунофлюоресценции, При обнаружении специфического свечЕния проверяют реакцию антител с дру1 гимн кЛетками крови доноров. После тестирования продуцирующие гибридомы кпонируют методом органических раэвЕдений на фидере из клеток селезенки и тимуса мыши в линии BAI.B/ñ.

Для приготовления фидера тимус и селезенку разрушают в стеклянном гомогенизаторе Поттера., Взвесь клеток фильтруют через марлевый фильтр. Клетки разливают в среде роста по 0,1 мп в лунки 96-луночного плоскодонного плато. Через l 7 дней плато используют как фидер. При клонировании клетки иэ продуцирующей лунки снимают нежным пипетированием. Количество клеток подсчитывают в камере Горяева и разводят в среде до конечной концентрации 50 клеток в 10 мл среды роста. Клетки разливают по О,I мл . в лунки на фидер. При этом на две лунки приходится одна клетка.

После первого клонирования клоны гибридных клеток появляются на четырнадцатый день в 25 иэ 96 лунок. Про-. 45 водят тестирование гибридом на Т-клет-! ки человека и иэ положительной лунки гибридому вновь клонируют. Ко лонки возникают на двенадцатый день в 58 из 96 лунок. Проводят скрининг на Т-клетках. Позитивные клоны поеле клонирования составляют 100 (58 из

58) °

Полученньп штамм обозначен ИК0-45.

Штамм гибридных клеток депонирован под номером BCKK(II) Ф 3140 и характеризуется следующими признаками.

Культуральные свойства.

Культивирование in vitro, Для выращивания штамма используют пластиковую или стеклянную посуду. Во флакон объемом 45 смз в 5 мл среды запивают по 5 10 клеток штамма. Пассаж 1 раз в 3-4 дня той же дозой ° Штамм выращивают при 37 С на среде RPHI-1640 или среде MEN в IX модификации Дульбекко, содержащей 15,0 оленьей или телячьей эмбриональной сыворотки; 2 м11/мл глютамина; О, 1 мг/мл гентамицина, Культивирование in vivo, Для выращивания опухоли из штамма гибридных клеток при годны мьппи самки линии, BALB/с. Интактным мьш ам за 1-7 дней до прививки опухоли вводят внутрибрюшинно (в/бр) по 0,5 мп вазелиново"

ro масла, Клетки гибридомы вводят в/бр по 10" клеток на мышь в 4 мл среды. Через 7-10 дней у мьппей возникают асцитные опухоли. Культуру клеток гибридомы поддерживают серийными пассажами асцитной опухоли.

Характеристика, полезного продукта.

Гибридома продуцирует моноклонапьные антитела ХяГ 3 класса. Специфич -ность — моноклональные антитела

1ИКО-45 выявляют новый эпитоп антигена

СП38 с мол.м. 45000 дальтон. Специфичность моноклональных антител определяют в непрямой реакции поверхностной иммунофлюоресценции по стандартной методике. Титр антител в культуральной жидкости 1:50, титр антител в асцитической жидкости 1: 100000.

Срок хранения MOHOIQIOHBJIbHblx антител при минус 20 С 1 год. Стабильность продуцирования антител сохраняется на протяжении 25 пассажей ин витро, 15 пассажей ин виво, Кри ок онс ер вир о в ани е, Клетки шт амма ре су спендируют в среде КРАП 1640, содержащей 20 телячьей эмбриональной сыворотки, к суспензии клеток добавляют 10% диметилсульфоксида (ДИСО) до конечной концентр.ации 10 . Количество клеток на

1 ампулу объемом 1 мп составляет 10-20 10, Замораяивание.проводят при с о

-70 С в течение 2 ч, затем ампулы с— клетками помещают в жидкий азот. Размораживание проводят при 40 С в тече о ние 70 с. Ампулы с клетками центрнфугируют при 1500 об/мин 2 мин. Затем клетки, находящиеся в осадке, переносят во флакон объемом 45 см>, содержащий 7 мл среды RPNI 1640 с 15 . телячьей эмбрионапьной сыворотки, изобретения

Фор мул а

iver " авитель Г.Смирнова

Техред М.Дидык Редактор М.Петрова

Корректор Т,Палий Заказ 2889 Тираж 498 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно †издательск комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина,101

5 159

2 мМ/мл глютамина, 0,1 мг/мп гентамицина. Жизнеспособность клеток после . размораживания по включению трипанового синего составляет 60Х.

Конт ами нация .

Бактерии и грибок при длительном культивировании и посевах на питателЬные среды в культиваторе не об наружены. Заражение, микоппазмой не выявлено.

Испапьзов ание моноклональных антител (монАТ), продуцируемых гибридомой, иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1 ° Использование моноклональных антител ИКО-45 для определения иммунологического статуса у больных раком молочной жепЕзы.

Содержание ИКО-45 положительных клеток в крови исследовано у 14 больных раком молочной железы II- Ш степени. Было обнаружено, что у 10 иэ

14 больных процент ИКО-45 положитель" ных клеток статистически значимо снижен по сравнению с контролем—

29,3+3;9 и 50,3+12,5 соответственно., Через 1-3 недели после операции процент ИКО-45 положительных клеток не изменился. Однако через 3-4 мес после операции количество ИКО-45 положи-:. тельных клеток возвратилось к норме.

Параллельное использование других монАТ, рутинно используемых для определения иммунологического статуса (ОКТ4, ОКТ8, ИКО-11) р подтвердило иммунодепрессивное состояние у этих больных до лечения и через 1-3 нед после операции и восстановление показателей иммунитета через 3-4 мес после операции, 5902 6

Пример 2. Использование моноклональных антител ИКО-45 для определения иммунологического статуса у ,цоноров крови.

Обследовано 12 доноров крови. Обнаружено, что у доноров крови процент

ИКО-45 положительных клеток колеблется от 35 до 70Х. У одного донора крови процент ИКО-45 положительных клеток резко снижен (20X) Применение других монАТ (ОКТ4, ОКТ8, 0КТ3, ИКО-11) подтвердило состояние иммунитета у этого донора, Таким о бр аз о м, по проценту ИКО-45 положительных клеток можно судить о . состоянии иммунной система человека.

МонАТ ИК0-45, полученные с помощью гибридоьы, определяют анти ген на од20 ноядерных клетках крови, по процентному содержанию которых можно судить о состоянии иммунной системы организма.

Преимуще ство использ ов ания монокпо25 напьных антител ИКО-45 по сравнению Г с прототипом ИКО-20 состоит в том, ччто налюминесцентном жкроскопе ИКО-45 ! ,определяют в норме 50Х антител" по.ложительных клеток, а ИКО-20 — 5X.

3р Это позволяет зафиксировать измене-ния антиген-положительных клеток, свидетельствующие о состоянии иммунной системы организма.

Штамм гибридных культивируемых клеток животных l4us musculus L.

i8CKK(II) У 314D, используемлй для пощ,лучения моноклональных антител к антигену CD38 кортикальных тимоцитов.