Способ флуоресцентной детекции иммобилизованных нуклеиновых кислот
Изобретение относится к молекулярной биологии и генетике и может быть использовано в других областях биологии и медицины для количественной детекции нерадиоактивно меченых нуклеиновых кислот. Целью изобретения является дифференциальная детекция двух ДНК-гибридизационных зондов в одном образце, исключение работы с радиоактивными препаратами и увеличение стабильности меченых зондов. Способ заключается в том, что два зонда метят нерадиоактивными гидразидом и биотином, которые после проведения гибридизации с одним образцом раздельно детектируют с использованием окисленного фермента β-галактозидазы и стрептавидина, конъюгированного с ферментом щелочной фосфатазы, при этом используются флуоресцирующие субстраты.
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
„„SU „„1613493 A 1 (g)) g (; 12 ((1/" 8.с.1
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
О С) О
О-Р О О- P-О
1 (-О оС
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР (2 1 ) 4 4 28 0 7, > 0-1 » (2?) 14. 10.88 (46) 15.12.90. Бк<п. ., 46 (71) Ииститут медици(к кс и гепетики с>" ill ((ÑÐ И НаУЧ»П>-ПРОИЗВОДСт(<С (11(OP
f< Il обт ef
< p(3JtáeJtäåð Д.
Цель изобретения — повышение эф<»>с ктивности способа за счет одновремепиой детекции двух зондов в одном образце и увеличен »я стабильности ч<ищов.
Способ состоит в том, что проводят гибридизацию с иммобил(»зованной
ДНК меченного ДНК-зонда, после;(ующую обработку раствором, содержащим фермент, и детекцию с помощью флуорес— це»тт»(ого субстрата, один из зондов метят гидра зид ом, др уг ой бис>тином, после совместиой гибридизащ»и прово6lf<>!1Of И МЕ;(И(а(ВЫ ддя КоЛИЧЕСтВЕИff<>l! лет с к(»и(» перагп(оа ктиttfto меченных цу (J(P((f(o (ft lx ки< л от . Цел ью и зо бр ет е(п(»»вл»ется д(»<Мсренцизл».ная детекци» двух 7!НК-гибриди «a(G»o((tfblx зо(щов в одt(otf обрз эце, исключе((ие работы с. радиоактивлы(а(препаратами и уве.шчеtttfo стаб((льпости мечеииых зо»щов.
Спос< 6 заключает< я 13 том, что два
3< (щ;l (»стят нс ради<>актив((ыми гидра—
3l(;lot(((биоти((ом, котор(»е после npo(3PJl< (tJ(» t ft6pttgIt(1atGtJ(с одt(ttst образцо t раздельно летектируют с исполь 3o13;lit lfc. »» окисJIP((I(oãî фермента P -ãà— .<(и КT < > 1(f <1<1 3Ы ll C TP ЕПТа ВИ, 11» 1(1 > КОНЪЮ гир >ва (н(ог<> с фермеf(tott щелочной фосф;(та:эы, при .этом t(c пользуются фл у<>p pc(а(р унт(а(p с убс тра Tt I, дят < бработку растворзна», содержащиt Gl Р -гал<»ктоз(»дз ..3 окисленную перио;(атом натрия, lf (пслочвую фосфатазу, сосд(»не((дую сî стрептазидииом, затем наносят раствор 4-tfpтилумбел— лие(»т»л-Р-гала ктозида и флуорес цеиндифос((>aта формулы
В данном спог обе гибриди зационные
ДНК-зо(щы метят двумя ра зными метка— ((1». При обработке после гибридизации к одной из них (гидрази. у) к< валеHòво присоединяют фермент !3 -галакто1613493 эида эу. Присоединение осуществл якл с и.пользовлнием способности окислспных периодатом натрия углеводных ос— тлтков, содержащихся в состав". P -ra— лактозидаэы, к химической реакции с гидразидом с образованием ковалентной связи. К другой метке (биотину) фериент щелочную фосфатазу присоединяют с помощью молекулы-посредника стрептлвидина, обладающегo высоким средстиои к биотину. В качестве субстрлтс в указанных ферментов применя— ют 4-метилумб»«лиферил- -,галактозид и»»»л уор »с цен ндифосфлт, обладающий ни .»к»«k флуоресценцией, которая значител -но возрлстлет при отщеплении
»з-глллктозид»и-1х и»Ьосфатных групп.
1 л сличив спектров эмиссии продуктов рсл,k!J«<, клтл |изируемой ферментами, «оэв лляет klpоводить регистрацию со«» ржлпия каждого из них в смеси и, следовательно, определять содержание и» krak«kk » i ДИК-зондов.
П р и и е р 1.,«,идх1 еренциальное опреде»ение ДИК, меченной гидразидом и биоти«ом в одном образце.
ДНК, иеченную карбогидразидом по
«»1з»1жению 0-4 цитозина (ДНК Т) и ме«ekkkkI и б1»с ти«ом с помощью фотоактиниру» мого релгеита (ДИК II) наносят нл «итр»тц»елл1»шозные фильтры по отдельности и совместно B одном пятне н количествах от 100 пг до О, 1 пг с носи т ел е (1 00 нг немеч е иной контрольной ДНК), л также отдельно контр» Iü!kóë ДИК (100 нг) . Иммобилизацию
«ронодят прогреванием в течение часа при 80 С. Далее фильтры выдерживают
30 ми в среде О, 1 M ацетата натрия, рН 5, 1, О, 5 . твин-20 и обрабатывают предварительно окисленной периодатом натрия 3 -галактозидазой (10 ед/мл) ! в тои же буфере без твин-20 при 25 С в течение 10 мин, после чего отмывают раствором 0,05 М натрий фосфата, рН 7,5, 0,1 !! Г!аС1, 5 мГ! MgClг
»
0, 05„твин-20 три раза по 5 MHH
Ватем обрабатывают коныогатом стрептавидин — щелочная Ьосфатаза в растворе О, 1 Г! трис-ИС1, рН 7,5, О, 1 Г1
Г!аС1, 5 мГ1 MgC1,» 15 минут при 25 С и отмывают этим же раствором с добавлением 0,05 твин-20 3 раза по
10 мин. Каждый кусочек фильтра с пятном ДИК переводят в 0,5 мл буфера О, 05 М трис-ИС1, рН 8, 2, О, 1 Г!
NaCI., м!! MgCI2, содержащего метил уибеллиферил-8-гала ктоэиц
45 (?О икг/мкл) . Выдерживают j ч при о
25 С и измеряют интенс.и«ность флуорс спенц и метилумб» 1:тиферона (Я о. — 360 нм; A „„ц„„,» = 450 нм) и флуор»зсцеин" (Ъ воъв 490 пм /! з исси», — 510 нм) . Зависимости интенсивности флуоресценции от количества ДНК на фильтре пока зывают близкие значения при определении ДИК с разными метка— ми в одном пятне и нанесенными по отдельности. Интенсивность флуоресцепции флуоресцеинл для гидра видной
ДНК и 4-метилумбеллиферонл для биотинированной ДНК соответствует фоновым значениям и не зависит от концентрации модифицированной ДИК. Следовательно, отСутствуют перекрестное взаимодействие и фактсры, препятствующие детекции ра «личных меток в одном пятне. Чувствительность способа позволяет определять до О, 1 пг меченной ДНК.
II р и м е р 2. Количественное определение двух различивши; последовательностей ДИК в одном образце.
Для «остроения калибровочной кривой нл литр о целлюлоз«» м фил ьтре иммобилиэуют смесь JlHI(двух немеченных г»ибридиэацис1 ных зондов (по 100 пг
1 пг) в присутст вии 100 k!r денатури рован«ой негомологичной ДНК, Гибридизацию с меченными гидраэидом и биотином зондами (!HK -NH-NH и ДНК—
В соответствс нно) проводят в буфере, содержащем 0,6 Г! NaC1, О, 2 мг/мл поливинилпирролидана, 0,07 Г! натрийфосфат, рН 7, 5, 500 мкг/мл РНК, 50 формамида и по 00 нг/мл каждого зонда в течение 16 ч при 37 С. После отиывки в буфере, содержащем О, 5 додецилсульфата натрия, 0,05 Г! NaC1
О, 07 натрий-фосфата, рН 7, 5, при
48 С в течение часа, фильтры обрабатывают, как описано в примере 1.Затем строят зависимость интенсивности флуоресценции от количества немеченной ДНК для каждого зонда.
После проведения гибридизации данных зондов с геномной ДНК, нанесенной на фильтры в количестве
100 пг и 500 нг, по полученным значениям флуоресценции и использованием калибровочной кривой определяют содержание гомологичных последовательностей в образце. Содержание
ДНК-NH-Г!Н2 в 100 нг геномной ДНК составляет 60 80 нг, ДНК-Б 1-2 пг, В
1613493 во.
Фор мула из обретения
Способ флуоресцентной детекции иммобилизованных нуклеиновых кислот, вклк>чающий гиГ>ридизацию с иммобилизованной ДНК двух меченных ДНК-зондов, с последующей детекцией меток, отли чающий с ятем,что,c целью повьш>ения эффективности с посо- О
P-o
О-Р
Составитель С.Бандрин
Редактор A. ÑïåñèBûõ Техр ел И. Дндык . Корректор И. Эрдейи
Заказ 3867 Тираж 487 Подпис ное
ВНИИ11И Государ твенного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæroðoä, ул . Гагарина, 10 1
500 нг геномной ДНК содержание ДНК-В опр еделяют в количестве 5-7 пг, Таким образом, предлагаемь>й спосо0 позволяет проводить ди >ференциальную детекцию двух различных последовательностейт ей нукл еи новых кислот в одном образце и с высокой чувствительностью определять их количестба за счет одновременнс и детеK!/AH двух зондов в одном бра зце и увеличения стабильности зондов, гибриди5 зацию проводят зондами, один пз которых метят гидразидом, а другой биотином с последующей обработкой
1 -галактоэидазой, окисленной периодатом натрия, и щелочной фосфатазой, 10 соединенной со стрептавидином, а затем раствором 4-метилумбелли«, ерил—
Р -гала ктозида и флуорес цеиндифосфата
*ор мулы
