Способ получения биотинузнающего реагента и способ обнаружения биотиновых меток в биологических макромолекулах

 

Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии и может быть использовано во всех видах работ, предусматривающих идентификацию биологического материала такими методами, как иммунодиагностика и гибридизационный анализ. Цель изобретения - улучшение качества биотинузнающего реагента при одновременном упрощении и ускорении процесса его получения и удешевление способа обнаружения биотиновых меток в биологических макромолекулах при сохранении высокого уровня специфичности анализа. Это достигается благодаря использованию нового биотинузнающего реагента - ацетилированного авидина, отличающегося высокой биотинсвязывающей активностью, низким уровнем неспецифической сорбции и сравнительно низкой себестоимостью вследствие получения его из доступного и относительно дешевого сырья при помощи предложенного несложного способа синтеза. Анализ, основанный на применении ацетилированного авидина, позволяет определять биотинированную нуклеиновую кислоту в количестве 1<SP POS="POST">.</SP>10<SP POS="POST">-12</SP> г. По специфичности распознавания биотиновой метки описываемый способ не уступает наиболее совершенному из известных методов, в котором в качестве биотинузнающего реагента применяют стрептавидин, и является при этом значительно более доступным и дешевым. 2 с.п. ф-лы, 6 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕС (ИХ

РЕСПУБЛИК

<39 Ви (ц) G 01 N 33/53, С 12 g 1/68

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И QTHPblTHRM

ПРИ ГКНТ СССР

2.ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ к двт0 жОм г СаиДКткльСтВМ (21) 4366947/31-13 (22) 20.01,88 (46) 15 ° 04.90. Бюл, № 14 (71) Новосибирский институт биоорганической химии СО АН СССР и Научнои 11 производственное объединение .Биолар (72) В,Ф,Куликова, А.В,Хадаев, О,А.Стенгревицс и И,К,Залите (53) 575(088.8) (56) G.Biol. Chem, 1980, 255, № 12, 5742-5746, Nuel.АсЫ.Res. 1985, 13, № 22, 8083-8091. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОТИНУЗНАЮЩЕГО РЕАГЕНТА И СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ БИОТИНОВЫХ МЕТОК В БИОЛОГИЧЕСКИХ МАКРОМОЛЕКУЛАХ (57) Изобретение относится к молеку- .. лярной биологии и биотехнологии и может быть использовано во всех видах работ, предусматривающих идентификацию биологического материала такими методами, как иммунодиагностика и гибридиэационный анализ, Цель изобретения — улучшение качества биотинузнающего реагента при одновременном упроИзобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии и может найти широкое применение во всех видах работ, предполагающих идентификацию биологического матерна. ла с помощью таких современных методов; как иммунодиагностика и гибрндизационной,анализ, Целью изобретения является улучшение качества биотинузнающего реа2 щении и ускорении процесса его получения и удешевление способа обнаружения биотиновых меток в биологических макромолекулах при сохранении высокого уровня специфичности анализа, Это достигается благодаря использованию нового биотинуэнающего реагентаацетилированного авидина, отличающегося высокой биотинсвязывающей активностью, низким уровнем неспецифической сорбции и сравнительно низкой себестоимостью вследСтвие получения его из доступного и относительно дешевого сырья при помощи предложенного несложного способа синтеза. Анализ, основанный на применении ацетилированного авидина позволяет определять З биотинированную нуклеиновую кислоту в количестве 1-10 г, По специфич-(2 ности распознавания биотиновой метки описываемый способ не уступает наи.

ЮВ более совершенному из известных методов, в котором в качестве биотинузнающего реагента применяюг стрепта-. видин, и является при этом значитель-, но более доступньм и дешевьи, 2 с,п, ф-лы, 6 табл, гента при одновременном упрощении и ускорении процесса его получения и удешевление. способа обнаружения биотиновых меток в биологических макромолекулах при сохранении высокого уровня специфичности анализа, Согласно предлагаемому способу в анализе используется новый биотинуэнающий реагент - ацетилированный ави дин, отличающийся от применяемого для

1557528

30 1 тех же целей сукцинилированного авидина более низким уровнем неспецифической сорбции, а также более простым и быстрым способом получения, Предлагаемый способ получения био.тинузнающего реагента заключается в том, что авидин инкубируют 25-30 мин с 0,05-0,1 М раствором уксусного ангидрида в буфере с рН 6,7-6,9 в присутствии 1-мегилимидазола в качестве катализатора и выделяют полученный продукт гель-хроматографией, В результате реакции ацетилирования "гасятся" положительные заряды аминогрупп белка и снижается его иэоэлектрическая точка, однако в отличие от сукцинилированного авидина ацетилированный не приобретает новых иониэированпых (отрицательно заряженных) групп, что дает ему преимущество при анализе положительно заряженных макромолекул, Условия реакции ацетилирования подбираются таким образом, чтобы блокирование сильно- 25 основных групп белка не затрагивало остатки, входящие s активный центр и отвечающие за связывание с био тином, и, следовательно, не приводило к снижению. биотинсвязывающей активности, что наблюдается пои получении сукцичилированного авидина, При выделении ацетилированного авидииа сокращается общее количество операций, в результате чего общее

;время его синтеза и очистки состав35 ляет 3-4 ч (против 1 5-2 сут для сукцинилированного производного) .

Новый биотинуэнающий реагентацетилированный авидин -.по своим

40 основным качествам (биотинсвязывающей активности и специфичности взаимодействия с биотином) практически не уступает гликопротеину стрептавидину (природному аналогу белка авидина), использование которого лежит в основе наиболее чувствительных и надежных способов выявления биотиновых меток в составе биологических макромолекул.

Однако стрептавидин получают до50 вольно сложным микробиологическим способом, тогда как авидин, являющийся исходным сырьем для получения предложенного реагента, примерно в

10 раз дешевле, получают его из бел- 55 ка куриных яиц, 1

Таким образом, предлагаемый способ обнаружения биотиновой метки на

Таблица 1

Концентрация уксусного ангид пипа М тепень модифиации (Е да0 /Еу@ . ) Опыт

0,05 1,45

2 0,07 1 45

3 0,10 1Ф45

4 0 15 1 45

5 0,01 1,.05

Оь005 0,99

7 (беэ метил, 0,05 1,05

Потеря биотинсвязывающей активное= ти, Реакция протекает не до конца, снижение чувствительности.

Пример 2, Получение биотин узнающего реагента, . Модификацию авидина проводят ана логично описанному в примере 1 при концентрации уксусного ангидрида основе применения ацетилированного авидина, приближаясь к известному (с использованием стрептавидина) по чувствительности, не уступает ему в специфичности распознавания биотина и оказывается значительно дешевле.

П р и.м е р 1, Получение биотинуэнающего реагента, К 1,0 мл раствора авидина (1 мг/мл)

В О, 1 М КН РО, (pH 6, 7) добавляют

4 мкл 1-метилимидазола (5,2 мМ) и перегнанный уксусный ангидрид (Г„

139-140 С) в количестве 5;7;10;

15;1;0,5 мкл (что соответствует следующим концентрациям уксусного ангидрида в смеси: О, 05; О, 07 О, 1 О;

Оу15; О» О 005 М). Затем реакцион» ную смесь инкубируют 25 мин при 20 С хроматографируют на колонке с сефадексом С-25 (10x300 мм) и элюируют

0,02 М .трис НС1, рН 7, Фракции, выходящие в свободном объеме колонки, со бирают. К полученному раствору биотинуэнающего реагента добавляют NaC1 до концентрации 0,1 N u NaNQ® до кон-. центрации 0,1Х и хранят при -18 С.

Потери активности препарата не наблюдается в течение 4 мес, Результаты модификации авидина в зависимости от концентрации уксусного ангидрида в растворе приведены в табл,1, 5 l5

0 05 М, но рН буфера изменяют в пределах 6,5-7,2.

Степень модификации авидина в зависимости от рН буфера приведена в табл,2, Т аб лица.2

Опыт рН буфера

Степень модификации (Еппп/Еаьо) l,45

1,45

1в45

1,40

1,05

6,6

6,9

6,9

7,2

6,5

9

l0

ll

1

Не достигается максимальная степень модификации, Пример 3. Получение биотинузнающего реагента, Модификацию авидина проводят аналогично описанному в примере 1 при концентрации уксусного ангидрида

0,05 М и рН буфера 6,7, но время инкубации меняют в пределах 20-35 мин.

Степень модификации авидина в зависимости от времени инкубации при. ведена в табл.3.

Таблица 3

СоотношеОпыт Количестптичесние сигнал/шум ая во,опреде ляемой ви русной, РНК,IÎ г лотность ри 440 нм, (o,е.) 30

57528 6 ляют раствор биотинированной пероксидазы (l MKI /мл), вновь промывают буфером А два раза по 3 мин и водой в о

5 течение 3 мин при 22 С для отмывки неспецифически связавшейся пероксидазы. Перокси азную активность проявляют в ячейках планшета для иммуноанализов в 0,1 М NH Ac (рН = 5,8) в присутствии 0,033 перекиси водорода. и 0 17. о-фенилендиамина в течение у О

1 ч при 22 С, О наличии искомой нуклеиновой кислоты судят по результатам измерения оптической плотности полученного комплекса при 440 нм, Общее время анализа составляет -1,5 ч, Для определения чувствительности предлагаемого метода и его калибровки содержание вирусной РНК предваритель20 но определено методом радиоактивной молекулярной гибридизации.

Результаты определения различных количеств вирусной РНК приведены в табл,4, Таблица.4

0i04

0,72

0,47

0,22

0,10

1 т

35 19

21

1

0,2

Ю

18

12

5,5

2,5

Опыт., 45

i,45

l 30

1,45

13 25

14 30.

l 5 20

1 6+ " 35

3а чувствительность анализа прини40 мают наименьшее количество РНК, при котором соотношение сигнал/шум больше трех, Пример 5, Выявление биотино вой метки в ДНК, Сравнение неспеци"5 фической сорбции биотинузнающих реагентов °

Пример 4, Выявление биотиновой метки в РНК и определение. чувствительности анализа, !

Суимарную РНК из мозга,мьппи, со-, 50 держащую 0,05-0, 1Х биотииированной

PHK вируса клещевого энцефалита и мобилизованную на ннтроцеллюлоэйом фильтре, обрабатывают раствором ацетилированного авидина (1 икг/мл) в

0,5 М KCl 0,02 М трис HCl 0,02 И

MgClg„ pH 7 ° 5 (буфер А) 5 мин при 22 С, Затеи носитель промывают . буферои А два раза по 2 мин и добавВремя инку- Степень модифибации (мин) кации

®азо Eggs) 4.

Реакция идет не до конца, Нецелесообразно,так как реакция заканчивается за 25-30 мин, Синтетический фрагмент к-ДНК ВКЭ, иммобилизованный на твердом носителе и несущий биотиновую метку, обрабатывают раствором ацетилированного авидина по примеру 1 (1 мкг/мл), Результаты измерения оптической плотности при 440 нм при определении 2 нг

ДНК составили 2 о.е,, уровень фонане более 0,05 о,е, (в качестве контроля исгользуют немеченую ДНК в количестве 1 мкг).

1557528

Величину неспеЦифической сорбции определяют аналогичным образом, но используя различные варианты ацетилированного авидина, стрептавидин и авидин, а в качестве тестируемого

Таблица 5

Опыт (» /Е ) Сигнал А 1 Фон А44о, 413 о,е, о,е, Узнающий реагент

1,45

1,05

1,40

1,45

0,98

0,50

0,80

0,80

0,75

0,50

0,80

0,04

0,80

0,70

0,75

0,03

0,80

Пример 6. Выявление биотино- .20 вой метки в белке, Сравнение ацетилированного и сукцинилированного авидина, Аналогичным образом проводят эксперименты с высокоосновиым белкомполи-1-лизином, Используют поли-.1-лизин со степенью полимеризации 30-40,,несущий 1 0-1 2 бнотиновых остатков (измерено но методу вьггеснения 4-оксиазо-2-карбоксибензола).В качестве 30 контроля используют немеченый поли-1лизин. Для анализа используют ацетилированный авидин (опыт 1) и сукцинилированный авидин. Полученные данные приведены в табл.6, 35 граблиus

Опыт Реагеит

Количество поли-1.-лизина, нг, с биоти- беэ био А44в ноя тика о,е;

28 Ацетилиро- ваиный ави0,50"5

0 04 дин

29 Сукцинированный ави0,80

0,40 дин

Приведенные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что использование полученного предлагаемым способом биотинузнающего реагента55 ацетилнрованного авидина - при выявле нии б но тинов ой метк и в биолог ич еских макромолекулах обеспечивает высо22 Ацетилированный авидин (опыт 1)

23 То же (опыт 5)

24 - " - (опыт 10)

25,- " — (опыт 4)

26 Стрептавидин

27 Авидин материала - фрагмент ДИК - гексадекатимидилат в количестве 10 мкг, Результаты измерений приведены в табл,5, I кую чувствительность (1 ° 10 г НК) и специфичность анализа (уровень неспецифической сорбции примерно такой же, как при использовании стрептавидина, в 10 раз меньше, чем для сукцинилированного авидина, и в 20-30 раз меньше„ чем для авидина).

Применение изобретения позволяет упростить и удешевить широко исполь-. зуемую в биотехнологии процедуру::: идентификации биологических макромолекул при помощи биотиновой метки, Формула изобретения

1, Способ получения биотинуэнающего реагеита, включающий инкубацию авидина в буферном растворе с модифи цирующим ангидридом и последующее выделение целевого продукта, о тличающийс я тем, что, с целью. улучшения качества реагента за счет снижения уровня неспецифической сорбции при одновременном упрощении и ускорении процесса его получения, авидин инкубируют 25-30 мин с 0,050,1 М уксусным ангидридом при рН

6,7-6,9 в присутствии катализатора

1-метилимидаэола, а выделение Ьродук» та осуществляют при помощи метода ° гель-фильтрации

2, Способ обнаружения биотиновых меток в биологических макромолекулах, включающий реакцию биологическо го материала, содержащего биотиновую метку, с биотинузнающнм реагеитом и последовательную обработку полученного комплекса биотинироваиным ферментом и хромогенным субстратом, о т1557528 личающийс я тем, что, с целью удешевления анализа при сохранении высокого уровня его специфичСоставитель О,Скуратовская

Техред Л.Сердюкова Корректор М.Шароши

Редактор Л,Веселовская

Тирам 514 Подписное комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.умгород, ул. Гагарина,101

Заказ 716

ВНИИПИ Государственного

113035, ности, в качестве биотинузнающего.. реа ге нта исполь з уют а цетилиров а нный авидин,