Способ приготовления питательной среды для культивирования клубеньковых бактерий

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа приготовления питательной среды для культивирования клубеньковых бактерий. Целью изобретения является повышение выхода клеток клубеньковых бактерий. Способ заключается в использовании в качестве источника азота минеральных и ростовых соединений биомассы водного растения пистии телоризовидной и источника углерода - сахарозы или иного соединения. Биомассу пистии телоризовидной в количестве 40,0-50,0 г/л измельчают, заливают кипящей водой, настаивают 2-4 ч, полученный настой фильтруют, доводят до 1 л, вносят сахарозу и стерилизуют. Приготовление питательной среды данным способом позволяет в 2,3 раза повысить выход клеток клубеньковых бактерий при культивировании RHIZOBIUM MELILOTI по сравнению с известными средами. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 С 12 и 1 20

ОПИСАНИЕ ИЗОВРЕТЕНИЯ

40 — 50,0 резовидная

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

К АВТОРСКОМ .Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 (21) 4454507/31-13 (22) 04.07.88 (46) 23,12.90. Бюп. У 47 (71) Институт микробиологии АН УЗССР (72) Г.Д.Золотилина, P.Ø.Øîÿêóáîâ и И.Д.Джуманиязов (53) 631.816 .211 (088.8) (56) Теппер Е.З., Шильникова В.К,, Переверзнева Г.И. Практикум по микробиологии. М., f972, с. 64 . (54) СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕД>! ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛУBEHbK0BblX БАКТЕРИЙ (57) Изобретение относится к биотехнологии и касается способа приготовления питательной среды для культивирования клубеньковых бактерий.

Целью изобретения является повышение

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа приготовления питательной среды для культивирования клубеньковых бактерий, Целью изобретения является повышение выхода клеток клубеньковых бактерий.

В способе приготовления питательной среды в качестве источника азота, минеральных и ростовых соединений используют биомассу водного. рас- . тения пистии телорезовидной, источника углерода - сахарову или другой субстрат при соотношении компонентов, г/л;

Пистия тело2 выхода клеток клубеньковых бактерий.

Способ заключается в использовании в качестве источника азота минеральных и ростовых соединений биомассы водного растения пистии телорезовид ной и источника углерода — сахарозы или иного соединения. Биомассу пистии телорезовидной в количестве 40,0—

50 0 г/л .измельчают, заливают кипящей водой, настаивают 2-4 ч, полученный настой фильтруют, доводят до t л, вносят сахарозу и стерилизуют, Приготовление питательной среды данным способом позволяет в 2,3 раза повысить выход клеток клубеньковых бактерий при культивировании

Rhizubium meliluti по сравнению с известными средами. 2 табл.

Сахароза 10 — 20,0

Вода Остальное

Биомассу пистии телорезавидной измельчают. заливают кипящей водой, настаивают 2-4 ч, Полученный водный настой пистии телорезовидной фильтруют, доводят до 1.л, вносят сахарозу и стерилизуют.

Нативная биомасса пистии телорезовидной на абс. сух. массу содержит, Х: сырой протеин 32,75, клетчатка 16,7, водорастворимые полисахариды 6,4; жир, кальций, фосфор, ка" лий )2,0, безазотистые экстрактивные вещества, микроэлементы, витамины, 1615176

Водный настой из 50 г пистии телорезовицной, отфильтрованный и доведенный до 1 л, представляет зеленовато-коричневую прозрачную жидкость с рН 8,0, содержит, Ж: сухие веще5 ства по рефрактометру 1,0, редуцирующи(е вещества 0,027., общий азот 1,1., П р и и е р 1. Для приготовления

1 ln питательной среды 50 r мелко нарезанной пистии телореэовидной заливают кипящей водой, настаивают 2 ч.

Полученный настой фильтруют, доводят до 1 л, вносят сахароэу в количестве

20,0 r и стерилизуют, . На укаэанной среде культивируют . ба ктерии Rhizobium meliloti 443а, Культуру клубеньковых бактерий gpep bi Rhizobium meliloti 443а подцдрживают и первоначально выращивают на скошенном бобовом arape рН 6,8-7,0 в,,течение 3 сут при 26-28 С в термост1ате.

, Необходимые объемы посевной культу ры готовят путем последовательных ступенчатых пересевов культуры в колбь Эрленмейера с большим объемом средЫ (рН 6,8-7,0) глубинным культивированием в условиях на качалке со скоростью 190 об/мин в течение 3 сут при 26-28 С и в ферментере при ино

30 тенсивности аэрации 0,59 л/мин и скорОсти механического перемешивания

5С10 o6/мин в течение 36-72 ч. Культивирование проводят по следующей технологии: косячок выросшей культу1 рь1 сливают в колбочку объемом 250 мл с 50 мл бобовой среды рост на као ча лке при 26-28 С в течение 3 сут.

7- 10 мл выросшей культуры переносят в колбу с 100 мл среды из пистии

pH. 6,8-7,0, 26-28 С, культивируют

3 сут. 30-50 мл культуральной суспензии переносят в колбу с 500 мл среды иэ пистии рН 6,8-.7, О, 26-28 С, культи,вируют 3 сут °

Количество инокулюма для внесения в ферментер 7-10Х от объема среды с ти тром клеток 50 млн/мл. Титр клеток клубеньковых бактерий после 48 ч культивирования 72,0 млрд/мл.

Пример 2. Для приготовления

1 л питательной среды 50 r мелко нарезанной биомассы пистии телорезовидной заливают кипящей водой, настаивают 4 ч. Полученный настой фильтруют, доводят до 1 л, вносят сахарозу в количестве 20,0 r и стерилизуют, Посевной материал — двухсуточную глубинную культуру Rhizobium mel iloti вносят в охлажденную простерилизованную среду. Условия культивирования аналогичны примеру 1, Выход конечного продукта 75 млрд клеток в 1 мл среды.

Пример 3, Готовят питательную среду следующего состава, г/л воды: пистия телорезовидная 30,0, сахароза 15,0, Время настаивания пистии 2 и 4 ч, титр клеток Rhizvbium meliloti 443а 22,0 и 27,0 мпрц/мл соответственно.

Пример 4. Готовят питательную среду следующего состава, г/л воды: пистия телореэовидная 40,0; сахароза 15,0. Время настаивания пистии 2 и 4 ч, титр клеток клубеньковых бактерий Rhizoh1щп meliloti

443а 38,0 и 43,0 млрд/мл °

Пример 5. Готовят питательную среду следующего состава, г/л воды: пистия телореэовидная 50,0, сахароза 10,0. Время настаивания пистии 2 и 4 ч, титр клеток Rhizobium

meliloti 443а 51,0 и 65,0 млрд/мл.

П р .и м е р 6, Готовят питательную-среду следующего состава, г/л воды: пистия телореэовидная 50,0, сахароза 15,0. Время настаивания пистии 2 и 4 ч, титр клеток Rhizobium

meliloti 443а 59,0 и 68,0 мпрд/мп.

Пример 7, Готовят питательную среду следующего состава, г/л воды: пистия телорезовидная 30,0, сахароза 20,0. Время настаивания пистии 2 и 4 ч, титр клеток Rhizobium

meliloti 443а 32,0 и 34,0 мпрд/мл.

Пример 8. Готовят питательную среду следующего состава, г/л воды. пистия телорезовидная 40,0, сахароза 20,0, Время настаивания пистии 2 и 4 ч, титр клеток Rhizobium

meliloti 443а 49,0 и 55,0 млрд/мп.

Пример 9. Готовят питательную среду следующего состава, г/л воды: пистия телорезовидная 75,0, сахароза 20,0. Время настаивания пистии 2 и 4 ч, выход клеток 73,0 и

75,0 млрд/мл.

Пример 10, Готовят питательную среду следующего состава, г/л воды: пистия телореэовидная 50,0, вода 1 л.

Культуры клубеньковых бактерий на водном настое пистии при рН 8,0 не растут. Подкисление настоя до рН 6,8 способствует росту культуры

5 i6! и через 48 ч культивирования численность Rhizubium meliloti 443а составляет 2,8 млрд/мл.

Пример 11. Готовят известную питательную среду на отваре бобовых растений (фасоли) с добавлением сахарозы. Титр клеток Rhizubium

meliluti 443а при культивировании в тех же условиях 32,0 млрд/мл.

Выход целевого продукта приведен в табл. 1.

Пример 12. Настой пистии телорезовидной может быть использован с другими источниками углерода.

Сравнительная оценка пригодности ее для культивирования Rhizobium

meliloti штамм 443а с различными источниками углерода в условиях роста на качалке прецставлена в табл.2, Данные показывают, что меласса, кукурузная патока могут быть использованы в составе среды наряду с такими источниками углерода как сахароза, пищевой сахар. Как видно из табл.1, время настаивания пистии телорезовидной не играет роли, Использование 30 г пистии для настоя является недостаточным, чтобы получить высокий

Способ приготовления питательной

20 среды для культивирования клубеньковых бактерий, предусматривающий приготовление водной вытяжки из растительного сырья с последующим смешиванием с источником углерода, о т.л и ч а ю—

25 шийся тем, что, с целью повышения выхода клеток клубеньковых,бактерий из растительного сырья,используют пистию телорезовидную в количестве 40-50 г/л.

Таблица

Титр клеток при культивировании через

48 ч, мпрд/мл

Время настаивания, ч стия Сахароза

32,0

22,0

27,0

Бобовая

30,0

15,0

40,0

38,0

43,0

2 4

15,0

51,0

65,0

10,0.50,0

59,0

68,0

15,0

50 0

20,0

32,0

34,0

49,0

55 0

72,0

75 0

30,0

40,0

20,0

50,0

20,0

75,0

20,0

73,0

75 0

50 0

2,8

Вариант Питательная среда, г/л

5176 6 титр клубеньковых бактерий, а более

50 г не увеличивает их численность и одновременно повышает вязкость нас5 тоя, ухудшает фильтрацию, На среде с пистией телорезовндной титр клеток увеличивается в 2,3 раза по сравнению с известной боковой средой при тех же условиях культивирова10

Таким образом, способ приготовления среды с настоем пистии телорезовидной позволяет повысить выход целевого продукта — титра спор клубеньковых бактерий Rhizobium meliluti. формулаизобретения

1615176

Таблица 2

Настой пистии телорезовицной при добавлении, г/л сахарозы 20 сахар пищемелассы

5-6

5-6

5-6

7-8

2,4

62,0

50 0

Составитель А,Кураков

Редактор Н.Гунько Техред JI.Сердюкова Корректор A.Обручар

Заказ 396 1 Тираж 490 . Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина, 101

Параметры процесса культивирования

Титр клубеньковых бактерий, 10 кл,/мл

Степень утилизации PB Х щевой 20

30 40 патоки кукурузной 30