Рекомбинантная плазмидная днк рек-7-днк-зонд для идентификации штаммов чумного микроба, несущих плазмиду пестициногенности, способ ее конструирования и штамм бактерий еsснеriснiа coli - продуцент днк-зонда для идентификации штаммов чумного микроба, несущих плазмиду пестициногенности

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к генетической инженерии. Целью изобретения является создание штамма E.COLI, содержащего рекомбинантную плазмидную ДНК, несущую фрагмент гена фибринолизина - коагулазы чумного микроба и обеспечивающую получение видоспецифичного зонда для идентификации штаммов чумного микроба, несущих плазмиду пестициногенности. ДНК-зонд фрагмент Р 1, являющийся частью структурного гена фибринолизина - коагулазы чумного микроба, позволяет идентифицировать штаммы чумного микроба, содержащие плазмиду пестициногенности. Р 1 - зонд видоспецифичен, он не гибридизуется ни с ДНК близкородственных бактерий - иерсиний, ни с ДНК бактерий других родов, продуцирующих фибринолизин (стафилококки, стрептококки, холерный вибрион). Сконструирована рекомбинантная плазмида рЕК 7, содержащая ДНК фрагмент Р 1 - часть структурного гена фибринолизина - коагулазы. Этой плазмидой трансформирован штамм ESCHERICHIA COLI К 802 и получен штамм, обеспечивающий синтез зонда для идентификации штаммов чумного микроба. Синтез вставки-зонда осуществляется в процессе репликации рекомбинантной плазмиды. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

И А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

flO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯЦ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4617786/30-13 (22) 07. 12.88 (46) 23.12.90. Бюл. Ф 47 (71) Всесоюзный научно-исследовательIr и ский противочумный институт Микроб (72) Е. Г. Булгакова и Ю.А. Попов (53) 577.2 (088.8) (56) Rubin F,А, Kupleko, Noon К.F,, Baron Ь.S,I. Clinical Microbiul. °

1985, 22, У 4, р.; 600-605.

Vensatensan М. et а1. 8 7th, Аппи

Meet Allauta, Ga 1-6, Macch, 1987, Washington D.Ñ. 1987. (54) РЕКОМБИНАНТПАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК

ЕК7-ДНК-ЗОНД ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ hlTAM

МОВ ЧУМНОГО МИКРОБА, НЕС."4ИХ ПЛАЗМИДУ

ПЕСТИЦИНОГЕННОСТИ, СПОСОБ ЕЕ КОНСТРУИРОВАНИЯ И ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI КМ6/рЕК7-ПРОДУЦЕНТ ДНКЗОНДА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ШТАММОВ ЧУМ-

НОГО МИКРОБА, НЕСУЩИХ ПЛАЗМИДУ ПЕС. ТИЦИНОГЕННОСТИ (57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии. Целью изобретения является создание штамма Е.coli, содержащего рекомбинантную ппаэмидную

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и представляет собой фрагмент ДНК, предназначенный в качестве зонда для идентификации методом гибридизации штаммов чумного микроба, несущих плаэмиду пестициногенности, способ конструирования .рекомбинантной плазмиды " продуцента

„,SUÄÄ 1615181 А 1 (51) 5 С 12 1/68 C 12 N 15/31

2 ДНК, несущую фрагмент гена фибринолизина — коагулазы чумного микроба и обеспечивающую получение видоспецифичного зонда для идентификации штаммов чумного микроба, несущих плазмиду пестициногенности. ДНК-зонц фрагмент Р, являющийся частью структурного гена фибринолизина — коагулазы чумного микроба, позволяет идентифицировать штаммы чумного микроба, содержаане плазмиду пестициногенности. P - зонд видоспецифичен, он ,ие гибридизуется ни с ДНК близкородственных бактерий. — иерсиний, ни с

ДНК бактерий других родов, продуцирующих фибринолизин (стафилококки, стрептококки, холерный вибрион).

Сконструирована рекомбинантчая плазмида рЕК7, содержащая ДНК фрагмент

P — часть структурного гена фибри1 нолиэина — коагулазы. Этой плазмидой трансформирован штамм Eschirichia

culi К 802 и получен штамм, обеспечивающий синтез зонда для идентифика) е ции штаммов чумного микроба. Синтез вставки-зонда осуществляется в процессе репликации рекомбинантнои плазмиды. 3 с.п. ф-лы, 1 табл ., СЛ

Фив>

ДНК-зонда и штамм бактерий, содержащий рекомбинантную плаэмиду — процу-. .цент ДНК-зонда.

Плазмида пестициногенности чумно- и го микроба (pPst), присутствует в большинстве штаммов этого микроорганизма в отличие от других представителей рода, Yersinia. Плазмида несет гены, ответственные эа синтез видео1615181

40 с пецифических антигенов: пестицина 1, фибринолизина и коагулазы, Эти особенности pPst предполагают возмож-. ность получения на ее основе видоспе5 цифического ДНК-зонда для идентификации чумного микроба.

Целью изобретения является созда ние штамма бактерий Е, culi со1цержащего рекомбинантную ДНК, несу" ую фрагмент гена фибринолизина и, оагулазы чумного микроба. и обеспеЧивающую получение видоспецифичес кого зонца для .идентификации штаммов чумного микроба, несущих плазмиду пестициногенности, Плазмица рЕК7, несущая фрагмент Ð, являющийся частью гена фибринолизина и коагулазы, локализованного на плазмиде пестициногенности (pPst) 20

:и используемый как зонд, состоит из следующих элементов: плазмидная ДНК

,вектора рАТ153 размером 3,314 т.п,н,, Ндпй III — BamH I — фрагмент pPst, содержащий часть структурного гена 25 фибринолизина и коагулазы размером

900 п.н,, молекулярная масса плазмиды рЕК7 2,SMD (4,214 т.п.н.), Ь1а-. ген, обеспечивающий синтез -лактамазы и устойчивость к ампициллину, 30 часть tet-гена, обеспечивающего устойчивость к тетрациклину, уникальные сайты рестрикции Ava I, Pst I, BamH I, Cla I, $а1 I, Hind III,. Bgl II; Kpn I.

Синтез вставки-зонда осуществля35 ется в процессе репликации рекомби| .нантной плазмиды, Используют, способ конструирования плазмиды, несущей фрагмент Р1 заключающийся в том, что плазмиду пестициногенности подвергают совместному гидролизу эндонуклеазами рестрикции НЕпс1 III u

BamH I, процукты гицролиза разделяют в агарозном геле и меньший из двух фрагментов элюируют, плазмидную ДНК рАТ153 подвергают совместному гидролизу эндонуклеазами рестрикции

Hind III u BamH I,ïðîäóêòû гидролиза разделяют в агарозном геле и больший из двух фрагментов элюируют, выделенные и очищенные фрагменты соединяют ДНК"лигазой, затем полученной смесью трансформируют клетки Е. coli K802 трансформанты высе1 5 вают на среду с ампициллином,, отбирают кпоны, чувствительные к тетрациклину и несущие Hind III - ВашН I вставку, идентичную по подвижности

Hind III — БатН 1 — фрагменту pPst (проверяется рестрикцией и электрофорезом), и из этих клонов выделяют плазмиду, обозначенную рЕК7.

Штамм — продуцент ДНК-зонда цля идентификации чумного микроба получают трансформацией клеток Е. coli

К-802 рекомбинан ной пла змидной

ДНК рЕК7 ° Уровень синтеза зонда в ! составе плазмиды в сконструирован номм штамме составляет 0,8-1 мг на

1 л при плотности культуры 0,4 при

0D 6oo °

Штамм Е, coli К-802, соцержащий рекомбинантную плазмидную ДНК, характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки: клетки прямые, палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные, Культуральные признаки. клетки хорошо растут на обычно используемых питательных средах. На 1,5Å-ном питательном агаре "Дифко" колонии шероховатые, матовые, круглые, края колоний волнистые. При выращивании в жидких YT LB-средах образуют ровную интенсивную муть.

Физико-биохимические признаки: оптимальная температура культивирования 37 С, оптимум рН 6,8 — 7,5, 0

В качестве источника углерода используют углеводы, органические кислоты, спирты, В качестве источника азота используют минеральные соли (в аммонийной или нитратной форме), органические соединения (в виде пептона, триптона, аминокислот).

Устойчивость к антибиотикам. проявляют устойчивость к ампициллину (50-100 мкг/мл).

Способ получения рекомбинантной плазмидной ДНК рЕК7 осуществляют следующим образом.

Пример. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК рЕК7 и получение штамма Е,coli К-802 — продуцента Р<-зонда для идентификации штаммов чумного микроба.

А. Выделяют плазмидную ДНК pPst из штамма Y.pestis PKR133 (pPst) и вектора рАТ153 из штамма Е,coli

ДНК (рА153). Клетки бактерий Y.pestis PKR133 (pPst) выращивают в

250 мл бульона LB с аэрацией в течение ночи. Клетки бактерий E. coli

DHI (рАТ153) подращивают 2,5 ч в

250 мл бульона ЬВ и амплифицируют

15181

О

0,8%-ном агарозном геле. С помощью цлинноволнового ультрафиолета визуализируют положение меньшего (900 п. н. ) Hind I II — ВашН I фраг5

i мента (рестриктазы Hind III u BamH I расщепляют pPst на 2 фрагмента) и электроэлюиронанием в ванночку извлекают его из геля. Злюат экстрагируют фе"олом, хлороформом и обрабатыBaю . эфирс м. ДНК плазмиды рАТ153 (10 мкг) подвергают гидролизу рестриктазами Hind III u BamH I по методике, описанной ныше. Больший

15 (3,3 т.п.н.) из двух полученных в результате гидролиза фрагментов извлекают из геля. электроэлюцией. Злюат очищают от примесей агарозы и смешивают с злюатом, содержащим Hind III

20 "BamH I — «ррагмент рРзс, ДНК осаждают 96Х-ным этаколом, промывают 70Хнь«м зтанолом и подсушивают, Осадок растворяют н буфере для легирования (0,066 М трис-НС1, рН 7.,5; 5 мМ

MgC1<, 5 мМ дитиотрейтола и 1 мМ АТФ) с добавлением ДНК-лигазы фага Т-4 (5 ец,). Легирование проводят 10

12 ч при 16 С.

В. Анализ рекомбннактных плазмид

30 и получение штамма — продуцента Р1зонда для диагностики штаммов чумного микроба, 1 хлоРамфениколом (С = 20 MKr/мл)

ДНК плазмид pPst и рАТ вь«деляют.

Клетки бактерий осаждают центрифугиронанием (6000 об/мин, 4« С, 15 мин) . Осадок ресуспендируют в

10 мл раствора 1 (50 мМ глюкоза, 25 мМ трис-НС1, рН 8,0, 10 мМ ЗДТА), добавляют лизоцим до С «< = 5 мг/мл и инкубир уют 5-10 мин при комнатной температуре, Добавляют 20 мл свежеприготовленного раствора 2 (0,2 н, Na0H, 1X SDS) перемешивают содержимое и r.íêóáèðóþò 10-15 мин при комнаткой температуре. Добавляют

15 мл раствора 3 (охлажденный 5 М ацетат натрия, рН 4,8), перемешивают соцержимое и инкубируют во льду

30 мик. Лизат осветляют центрифугированием при 4« С 20 мин при

20000 об/мин. К надосадочной иждкости добавляют 0,6 объема изопропанола и инкубируют 1-2 ч при 15 C,ÄÍ!< осаждают центрифугированием при

12000 об/мин в течение 30 мин при комнатной температуре. Осадок подсушивают, растворяют в буфере ТЕ, рН

8,0. Дальнейшую очистку ДНК проводят по известной методике равновесным центрифугиронанием в градиенте хлористого цезия с бромистым. этидием.

Разница в выделении pPst по сравнению с рАТ153 заключается только н том, что осадок, полученный из 250 мп ночной культуры Y. pcs tis РКК133 (pPst) суспендируют в 60 мл раствора i а осадок из 250 мл амплифицированной культуры Е.coli DHI (рАТ153)— в 10 мл раствора 1. Далее условия лизиса клеток и очистки идентичны для обеих культур.

Концентрацию ДНК плазмид pPst u рАТ153 определяют спектрофотометрически при 260 нм. Полученные препараты ДНК плазмид pPst и рАТ153 используют для конструирования плазмиды рЕК7, Б. Клонирование Н1п«! III — BamH I фрагмента плазм,«ды пестициногенности в векторной плазмиде рАТ153. ДНК плазмиды pPst (10 мкг) инкубируют с эндонуклеазами рестрикции Hind III (8 ед.) и BamH I (8 ед,) в среднесолевом буфере (50 мМ КаС1, 10 мМ (рН 74) трисНС1, 10 мМ MgS0q, 1 мМ ДТТ) при 37«rC

1 ч, Реакцию останавливают добавлекием 0,5 М ЗДТА, рН 7, до конечной ко ц нтрации 10 мМ, Продукты гидролиза разделяют с помощью электрофор еза в

Полученную смесь ДНК глазмид используют для трансформации клеток

F.. col i К-802. Трансформированные клетки подращивают 1 ч в бульон

LB и нысевают на агаризованную среду

LB с ампициллином (20 мкг/мл) . Клоны, выросшие на среде с ам«глциллином, лизируют и анализируют методом электрофореза в агарозном геле. Отбирают клоны, содержащие плазмидную

ДНК с кесколько меньшей подвижностью, чем подвижность ДНК рАТ153. Наличие нужной вставки подтверждают, сравкиная эл ектрофореграммы рестриктов, полученных при гидролизе эндонукпеа50. зами Hind III и ВанН I плазмиц pPst, рАТ153 и плазмидной ДНК анализируемого клона, а также наличием сайтов рестрикции на ппазмидной ДНК клока для рестриктаз Крп I u Bgl II,имеющимся только на Hind III — ВашН I фрагменте pPst. Плазмидная ДНК, состоящая иэ крупного Hind ?П:—

j BamH I фрагмента рАТ153 и малого фра"мента Hind III — BamH I, обозна1615181 чена рЕК7, а клон Е. col i Х вЂ” 802, несущий гибридную плазмиду рЕК7, отобран как донор данной плазмиды.

Из клеток клона, содержащего плаз«юиду рЕК7, известными методами выеляют плазмицную ДНК, рестрикцируют е Bgl II — BamH I и ферментами и

ыделяют ДНК-зонд. фрагмент Р1. Заем полученный фрагмент с помощью ДНК 1О рансляции метят (P) и гибридизирут по известным методикам блоттинг-. ибридизации с хромосомальной ДНК фтаммов 7. рея в. Зонд Bgl II — BamH 1 ибридизируется только с плазмидной

НК pPst и не гибридизируется с другими исслецованными хромосомными и ппазмидными ДНК.

Зонд также используется для dut1 ибридизации с колониями различных

1 таммов бактерий по известной метоВ дике, Результаты гибридизации приведены в таблице, Изобретение позволяет получить 25

ДНК-зонд Р1, идентифицирующий штаммы чумного. микроба, несущие плазмиду

pPst. Получен штамм — хозяин Е.coli с гибридной плазмидой рЕК7, удобный для наработки и выделения данного

ДНК-зонда в необходимых количествах, !

Гибридная плазмида рЕК7 многокопийная, обладает удобным селективным маркером — устойчивостью к ампицили ину, амплифицир ует с я хлор амф е ни к о-.

IJIoM, Фрагмент плазмиды пестициноген,.ности, предложенный в качестве зонда, легко вырезается из рЕК7 при совмест ном гидролизе рестриктазами Bgl II и ВатпН 1, которые делят плазмиду 40

:на два фрагмента с различной подвижностью в агарозном геле.

Формула и з о б р е т ения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК рЕК7-ДНК-зонд для идентификации штам-.45 мов чумного микроба, несущих плазмиду пестициногенности, содержащая плазмидную ДНК вектора рАТ153, размером

3, 314 т, и. н., Hind II I — BamH I фрагмент Р1 плазмиды пестициногенности pPst с частью структурного гена фибринолизина и коагулазы размером 900 п.н.; Ь1а-ген, обеспечивающий синтез )-лактамазы, часть tpt гена, обеспечивающего устойчивость штамма к тетрациклину, уникальные сайты рестрикции Ava I Pst I, BamH I, Сlа I, $а1 I, Hind III, 2. Способ конструирования рекомбинантной- плазмидной ДНК рЕК7-ДНКзонд для идентификации штаммов чумного микроба, несущих плазмиду пестициногенности, заключающийся в том,. что ДНК плазмиды пестициногенности подвергают совместному гидролизу эндонуклеазами рестрикции Нind III и EamH I продукты гидролиза разделяют с помощью электрофореза в агаровном геле, меньший фрагмент

Hind III — BamH I эпектроэлюцией выделяют из геля, векторную плазмидную

ДНК рАТ153 подвергают совместному гидролизу эндонуклеазами рестрикции

Hind III u BamH I, продукты гидроли- . за разделяют с помощью электрофореза в агарозном геле, больший фрагмент

Hind III — BamH I выделяют из геля, полученные фрагменты соединяют с помощью ДНК-лигазы, после трансформации этой смесью клеток Е.cvli отбирают тетрациклин-чувствительные клоны и из них выделяют плазми;;у рЕК7.

3. Штамм бактерий Escherichia coli

KM6/рЕК7 — продуцент ДНК-зонда для идентификации штаммов чумного микроба, несущих плазмиду пестициногенности, !

1615181

Гибридизация с P -зонцом

Наличие

pPst

Штамм

Фибринолиз Yersinia pestis EV

Yersinia pestis Yava

Yersinia pestis 1146

7ersinia pestis 1680

Yersinia pestis PKR 133

Yersinia pestis PKR 133 (pFra)

Yersinia pestis PKR 133 (pCad)

Yersinia pestis PKR 133 (pPst)

Yersinia pseudotyberculosis I(84 7)

Yersinia pseudotyberculosis II(837)

Yersinia pseudotyberculosis ИХ(824)

Yersinia pseudotyberculosis IV(807)

Yersinia pseudotyberculosis V(810)

Yersinia pseudotyberculosis Ч(810)

Yersinia pseudotyberculosis VI(110), Yersinia pseudotyberculosis 66

Yersinia pseudotybercuIosis 67

Yersinia pseudotyberculosis 68

Yersinia pseudotyberculosis 69

Yersinia pseudotyberculosis 70

Yersinia pseudotybercu1osis 4!4

Yersinia pseudotyberculosis 4 14 (оСад)

Yersinia entегоcolitia 867.

Yersinia entегоcolitia 885

Yersinia entегоsolitia 1367.

Yersinia bovicidae 7

Salmonella typhimurium 4.

Salmonella enteritidis 103

Shigella sonnae 18929

Streptococcus viridis 1

Streptococcus pyogenes 654

Staphylococcus aureus 209

Staphylococcus aureus 6537

Staphylococcus aureus 3256

Vibrio chulerae cholerae 569B

Е. coli Я 925 (pPst)

Е. coli 9925

Е. coli $925 (рВК322)

Е. coli Я 925 (pEK4) Гибрид-ДНК

Е. coli НВ 101

Е. coli 0600

Составитель Е.Кузнецова

Редактор Н. Гунько Техред Л. Сердюкова Корректор M. Самборс кая

Заказ 3961 Тираж 496 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ. СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101