Способ исследования свойств клеточных мембран при замораживании

 

Изобретение может быть использовано в биотехнологии, пищевой промышленности , медицине и биологии. Целью изобретения является повышение информативности способа. В способе берут дополнительный образец суспензии клеток и измеряют в этом образце при исходных значениях темИзобретение относится к фи.ическим методам исследования вещества на основе явления ЯМР и может быть использовано в биотехнологии, медицине, биологии и других областях естественных наук, где в процессе замораживания или образования льдоподобных структур (типа клатратов газов) необходимо проводить быстрый и точный контроль свойств клеточных мембран или замкнутых полупроницаемых оболочек . Цель изобретения - повышение информативности способа. пературы и осмотического давления внеклеточной среды амплитуду сигнала ядерного магнитного резонанса (ЯМР) от протонов внутриклеточной воды и среднее время жизни молекул воды в клетках, переохлаждают этот образец до температуры замораживания и повышают в нем пропорционально концентрацию компонент внеклеточной среды таким образом, чтобы осмотическое давление внеклеточной среды в дополнительном образце при этой температуре в переохлажденном состоянии было равно осмотическому давлению внеклеточной среды в замороженном состоянии основного образца, измеряют те же параметры в переохлажденном состоянии, далее переводят образец в исходное состояние и измеряют в этом состоянии амплитуду сигнала ЯМР от протонов внутриклеточной воды и среднее время молекул воды в клетках. 2 ил. i (Л На Лиг.1 схематически представлены упрощенные зависимости изменения количества неповрежденных клеток в основном (сплошная кривая 1 и пунктирная кривая 2) и дополнительном (кривая 3) образцах при понижении температуры образцов от исходной температуры на фиг. 2 - те же кривые с нормированным значением ординаты N/N и , где N и N9 - количество клеток в основном и дополнительном образцах соответственно, NM и N.. - количество клеток в-основном и дополнительном образцах со-, ответственно в исходном состоянии (при исходных значениях температуры о со со 00

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 G 01 N 24/08

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСНОМЪ(СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4448816/25 (22) 27.06.88 (46) 28.02.91.Бюл. К - 8 (75) В.Г.Рыжов (53) 547.543.4 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

Р 1224693, кл. G 01 N 24/08, 1986, Сахаров Б.В.и др. Проницаемость и повреждение мембран эритроцитов при температурах от -1 до -9 С по данным метода ЯМР релаксации. — Физика, т.ХХ!Х, 1984, в.2, с. 264. (54) СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ СВОЙСТВ

КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН ПРИ ЗАМОРАЖИВАНИИ (57) Изобретение может быть использовано в биотехнологии, пищевой промышленности, медицине и биологии.

Целью изобретения является повьпцение информативности способа. В способе берут дополнительный образец суспенэии клеток и измеряют в этом образце при исходных значениях темИзобретение относится к фи-:;ическим методам исследования вещества на основе явления ЯМР и может быть использовано в биотехнологии, медицине, биологии и других областях естествен- ных наук, где в процессе замораживания или образования льдоподобннх структур (типа клатратов газов) необходимо проводить быстрый и точный . контроль свойств клеточных мембран или замкнутых полупроницаемых обо,лочек.

Цель изобретения — повышение информативности способа.

2 пературы и осмотического давления внеклеточной среды амплитуду сигнала ядерного магнитного резонанса (ЯМР) от протонов внутриклеточной воды и среднее впемя жизни молекул воды в клетках, переохлаждают. этот образец до температуры замораживания и повышают в нем пропорционально концентрацию компонент внеклеточной среды таким образом, чтобы осмотическое давление внеклеточной среды в дополнительном образце при этой температуре в переохлажденном состоянии было равно осмотическому давлению внеклеточной среды в замороженном состоянии основного образца, измеряют те же параметры в переохлажценном состоянии, далее переводят образец в исходное состояние и измеряют в этом состоянии амплитуду сигнала ЯМР от протонов внутриклеточной воды и среднее время жизни молекул воды в клетках. 2 ил.

CA

На фиг.1 схематически представ- ь лены упрощенные зависимости измене- фф ния количества неповрежденных клеток (;ф в основном (сплошная кривая 1 и пунктирная кривая ?) и дополнительном (кривая 3) образцах при понижении температуры образцов от исходной температуры Ти, на фиг.2 — те же кривые с нормированным значением ординаты, N/N> и N /И„, где М и N — колиа а . а честно леток в основном и дополни- Ь тельном бразцах соответственно, N u N — количество клеток в осЭ

И И новном и дополнительном образцах со-. ответственно в.исходном состоянии (при исходных знапениях температуры ют в этом состоянии параметры 1. и,,а л

О и

По отношениям амплитуд в основнок и дополнительном образцах судят о проценте клеток, мембраны которых повреждены."в результате увеличения осмотического давления внеклеточной среди при замораживании; из-за образования льда при замораживании; вследствие рекристаллизации льда при отогреве.

По отношениям времен жизней в ос- . новном и дополнительном образцах судят об изменении диффузионной водной проницаемости (ДВП) вследствие: изменения осмотического давления в цикле замораживание — отогрев; механического воздействия льда при замораживании; действия льда в ходе цикла замораживание — отогрев.

Если в процессе замораживания клет ки не повреждаются, то по отношениям амплитуд и времен жизней молекул воды в клетках основного и дополнительного образцов дополнительно судят об изменении ДВП в результате увеличения .осмотического давления внеклеточной среды в замороженном состоянии.

На фиг.1 схематически представлены упрощенные зависимости изменения количества неповрежденных клеток в основном N (кривая 2 — без замораживания, кривая 1 — c замораживанием) и дополнительном Nd (кривая 3) образцах при понижении температуры образцов от исходной ТИ до температуры замораживания (переохлаждения)

Т, Т вЂ” температура начала гибели клеток от образования льда в основном образце, N Ngy и N — количество клеток в основном и дополнительном образцах при температуре Т .

Принимая во внимание фиг.2, оценивают процент погибших клеток в результате образования льда,при замор ажив анин

ЬЗ=(NAÚ/N. ™Ъ/Ы.)/(N.ð/N.) =

= 1-(Ю„/И„) /(Ы„>/И„), (1)

Очевидно, что

9 qg= ag " = any ° где Va> и Va — объем воды в клетке в исходном и замороженном состояниях в основном образце;

3 1 31381

Т и осмотического давления П„).

Способ возможно осуществить при помощи стандартного ЯМР спектрометра.

Способ осуществляют следующим образом.

Приготавливают два образца суспензии клеток в исходном состоянии (при исходных фиксированных значениях осмотического давления П и температу- 1 ры Т ). Измеряют в этом состоянии в основном образце амплитуду сигнала

ЯМР от протонов внутриклеточной воды

М„, среднее время жизни молекул води в клетках 9 „и в дополнительном образце — амплитуду сигнала ЯМР от протонов внутриклеточной воды Na .

Э

Переохлаждают клетки основного образца до температуры замораживания Т л и измеряют параметры М и

ЯМР от протонов внутриклеточной воды

М, среднее время жизни молекул води в клетках с@ и осмотическое давлеи

: ние внеклеточнои среды Пу, Затем размораживают клетки основного образца, повьш ая температуру до исходной Ти .и получают исходное значение осмотического давления внеклеточной среды

Пи, пропорционально изменяя концентрацию компонент во внеклеточной среде до исходной. При исходных значениях осмотического давления П и и темпе— ратуры Tg измеряют параметры М и

A и с„ „.

В дополнительном образце понижают температуру до Т и повышают пропорционально концентрацию компонент во внеклеточной среде так, чтобы в переохлажденном состоянии при этой температуре давление внеклеточной среды в этом образце было равно осмотическому давлению П внеклеточной среды в основном образце, замороженном при температуре Т .

Измеряют в дополнительном образце в переохлажденном состоянии при Т амплитуду сигнала ЯМР от протонов внутриклеточной воды М и средЯПф нее время жизни молекул воды в клетках 6 д . Затем, повышая темпера ла туру до исходной Т и пропорционально, изменяя концентрацию компонент во внеклеточной среде до исходного зна- 55 чения, переводят клетки .этого образца .+

1 вновь в исходное состояние (к исхопным значениям П < и Т„1 и измеря3 3

163

V и Ч вЂ” те же величины в доРи полнительном образце в исходном и переох" лажденном при температуре замораживания

Т состояниях соответственно.

Амплитуды сигнала ЯМР от протонов внутриклеточной воды в исходном состоянии для обоих образцов, замороженном для основного и переохлажденном для дополнительного образца состоянии соответственно записываются

Маис к Чаи и

3 9

M k Чаи Ми, M )= k V ) N),,а „,а,з аи = " ап п где k — коэффициент пропорциональности

Тогда выражение (1) можно представить в виде

Ь „ = 1-.(М„ /Маи)/(М /M ) . (2)

Исходя из кривой 3 (фиг.1). оценивают процент гибели клеток от осмотического эффекта

138 t ном образце при тех же условиях.

Очевидно, что V = V0 и. Поэтому

3 Э

Д=1 — М /М

Ф (4)

Определяют суммарный процент клеток, погибших в основном образце от осмотического эффекта и механического действия льда после всего цикла замораживание — отогрев (Nи- NÄÄ ) /N„= 1-Маии/МРИ (5)

15 где Маи = k Va ë Nè

Ри И "ии амплиту

Рни лов ЯМР от внутриклеточной воды в

20 основном образце в исходном состоянии до и после цикла заморажива-: ние — отогрев.

25 Причем очевидно, что V „ Ч ии, т.е. внутриклеточный объем до замораживания равен аналогичной величине после отогрева.

Процент погибших клеток от дей39 ствия льда в процессе размораживания выражается соотношением

Д„, = Д, -Д,-Д„>

Д. = (NÄ- Иии)/И, = 1-ГТю N„=

1 Ыи3/Миэ (3) д где Н ии — число клеток в исходном состоянии в дополнительном образце после перевода их из исследуемого переохлажденного состояния опять в исходное состояние.

Здесь считается, что при обратном переводе число клеток в дополнительном образце сохраняется, т.е.

Nap Иии. Амплитуды сигналов ЯМР от

9 внутриклеточной воды в дополнительном образце до и после перевода клеток этого образца в исследуемое (переохлажденное) -состояние записываются соответственно а я З З з з

Ри Ри "и ™аии = Чаии "ии-.

9 Э где Чаи и Чаии — объем воды в клетке в донолнитель35 3 Q

Д hp Маии/Ма и + (Ма /Маа ) /

/(мао /маи) маии/ма и

9 3

45 ДОп gî,+Д„= 2 (М /Ма„) а 3 (MII /Màè) /(Mаи /Маи)

Оценивают изменение проницаемости мембраны. По определению ДВП Р равно

Р = Ч,/(S.ë„), 3ek (8) где Ча — объем воды в клетке;

S — площадь поверхности клеточной мембраны;

6q — среднее время жизни воды в клетке.

Определяют также процент клеток, погибших от совместного действия осмотического эффекта и льда при замораживании. Очевидно, что

1631381

РИ Чои/(а ) Ри

3 аи

Чаи/(8 а„), (9) Причем

/ г чаи= "a

Р = Ча /($ а ), Рк Чап)/ (8 "ап ) а я,а и ай "Оп ) (10) (18) (11) а /("ап ) (12) где Чаии = Чаи

3 где Чаии Чаи = Чаии (14) а

= Чаи °.а

"аи/ "аии (16) Проницаемость в исходном, замороженном и переохлажденном состояниях обоих образцов соответственно выражается

ДВП после всего цикла замораживание — отогрев ии- аии/(сии) — Чаи /(a .) 1 (13) ДВП в дополнительном образце после перевода из переохлажденного состояния в исходное

Здесь считается, что S=const во всех состояниях и „ Фда вследствие п,9 ап механического контакта со льдом.

Изменение ДВП в результате действия льда при замораживании выражается

8,а л аRË (Рп Р)) / л "аа / а (15) Изменение ДВП от осмотического действия среды после переохлаждения при температуре Т, осмотическом давлении П и возврата в исходное состояние

6 К = Ь К, = (Р„- Ри, ) /Р„=1- „ /

Изменение проницаемости вследствие суммарного действия осмотического давления и льда после всего цикла замораживание — отогрев

ЬВоь Ри- Рии)/Ри = 1- а /„аии (17) Изменение проницаемости вследствие механического действия льда после цикла замораживание — отогрев

ЛК = Ьк -5R

h ОЛ о

15 p3

= с а и (1/ "О и и 1/"аии

Если при замораживании клетки не повреждаются, то изменение ДВП при температуре Т выражается соотношени» . ем

Ь "до (Ра Pg) /-п =1 (a any) /

25 /(1 яа "а (19) где М „и са,, — амплитуда сигнала

:1

ЯИР от протонов внутриклеточной воды и

30 среднее время жизни молекул воды в клетках в основном образце, в переохлажденном до температу35 ры Т состоянии.

В этом случае изменение проницаемости в результате увеличения осмотического давления при замораживании с учетом (15) записывается

40 лЭ

ЬВо = Мна Rqp= ап / а Жа "

""св )/(1ап " а,) . (20) Таким образом, введение указанным способом дополнительного образца клеток позволяет определить при любом строении клеточной стенки отдельно процент клеток, мембраны которых повреждены в результате увелич, ия осмотического давления внеклеточной среды при замораживании, действия льда как при замораживании, так и при размораживании, а также изменения

ДВП вследствие механического воздействия льда при замораживании, суммарного действия льда при замораживании и оттаивании и интегрального действия осмотического давления вне1631381

70 клеточной среды после цикла замораживание — отогрев. Если при замораживании клетки не повреждаются, то предлагаемый способ позволяет определить изменение проницаемости при температуре замораживания в результате действия осмотического давления внеклеточной среды.

Формула изобретения

Способ исследования свойств клеточных мембран при замораживании с использованием основного образца суспензии клеток, включающий измерение амплитуды сигнала ядерного магнитного резонанса (ЯМР) от протонов внутриклеточной воды переднего времени жизни молекул воды в клетках основного образца при исходных значе-. ниях температуры и осмотического давления с добавлением во внеклеточный

20 объем"гарамагнитных частиц, в пере— охлажденном состоянии,в эамороже»»ном при температуре переохлаждения состоянии и после размораживания, а также измерение осмотического давления внеклеточной среды в замороженном состоянии,о т— л и ч а ю шийся тем,что, с целью повышения HHAopMBTHBHQGTH способа, приготавливают дополнительный образец суспензии клеток в исходном состоянии, добавляя во внеклеточный объем этого образца парамагнитные частицы, переохлаждают клетки этого образца до температуры замораживания основного образца и увеличивают осмоти35 »еское давление внеклеточной среды и концентрацию парамагнитных частиц во внеклеточном объеме так, что ос" мотическое давление внеклеточной среды и концентрация парамагнитных частиц во внеклеточном объеме в дополнительном образце равны соответственно осмотическому давлению и концентрации парамагнитных частиц в замороженном состоянии основного образца, повышают температуру в дополнительном образце до исходной, изменяют осмотическое давление внеклеточной среды и концентрацию парамагнитных частиц до исходных значений и измеряют во всех указанных состояниях дополнительного образца амплитуду сигнала ЯМР от протонов внутриклеточной воды и среДнее время жизни молекул воды в клетках и по отношениям амплитуд сигналов ЯИР от протонов внутриклеточной воды измеренных в основном и допол" нительном образцах, судят о проценте поврежденных клеток и по отношениям средних времен жизни молекул воды в клетках в основном и дополнительном образцах судят об изменении дидх»»узионной водной проницаемости клеточных мембран, по совместному отношению амплитуд сигналов ЯИР от протонов внутриклеточной воды и средних времен жизни молекул воды в клетках в основном и дополнительном образцах судят также от изменении диффузионной водной проницаемости клеточных мембран, не поврежденных в процессе замораживания.

1631381

iylNi

>п Р4 д ll yg// и

+g/4 и Р

Pll2,8

Составитель В.Покатилов

Редактор И.Касарда Техред М.Дидык Корректор М.Демчик

Заказ 539 Тираж 375 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101