Способ определения микробной резистентности организма

 

Способ определения неспецифической антимикробной резистентности организма относится к иммунологии. Цель изобретения - упрощение и повышение точности способа. Указанная цель достигается путем взаимодействия цельной крови с микробами.Новизна способа заключается в том, что в качестве микробных субстанций используют микробный антиген в дозе 8,0 и более АЕ-0,1 в РТПГА,смесь инкубируют при 36-37°С в течение 10-15 мин, охлаждают в течение 20-30 мин при 3-7°С, добавляют 0,5 мл иммунной сыворотки активностью 3,0 и более АЕ/0,5 в РПГА,специфичнои к антигену, инкубируют при 3-7°С в течение 20 - 30 мин, центрифугируют, переносят 0,5 мл надосадочной жидкости в планшет и определяют антимикробную активность крови по остаточной активности антигена в АЕ/0,1 РТПГА. 1 табл. с SS (Л

А1

ССК33 СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

„,SU„„164 (g()5 G 01 1 1 33/53

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Я

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4366629/14 (22) 22.01,88 (46) 07.04.91. Бюл. N- 13 (71) Пермский государственный медицинский институт (72) В.Ii.Ðo÷ås, Н.И,Аверьянова .и А.А.Гаслова (53) 615.375 (038.8) (56) Журнал микробиол. 1976, II- 1, с. 19-25 (прототип). (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ И".КРОБНОЙ

РЕЗИСТЕНТНОСТИ ОРГАНИЗМА (57) Способ определения неспецифической антимикробной резистентности организма относится к иммунологии.

Цель изобретения — упрощение и повышение точности способа. Указанная

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и предназначено для объективного контроля за эффективностью лечения лекарственными препаратами, обладающими иммуностимулирующими свойствами, санаторнокурортными факторами и другими способами лечения, для определения индивидуального уровня антимикробной резистентности организма при различных физиологических и патологических состояниях, прогнозирования индивидуального уровня изменения неспецифической антимикробной резистентности организма при лечении больных, а также в других областях медицины.

Целью изобретения является упрощение и пов .а ение точности способа за счет, оценки суммарной антимикробной активности гуморальных и клеточных факторов по их способности бло-, I

2 цель достигается путем взаимодействия цельной крови с микробами.Новизна способа заключается в том, что в качестве микробных субстанций используют микробный антиген в дозе 8,0 и более АЕ- 0,1 в РТПГА,смесь инкубируют при 36-37 С в течение 10-15 мин, охлаждают в течение 20-30 мин при

3-7 С, добавляют 0,5 мл иммунной сыворотки активностью 8 0 и более

АЕ/0,5 в РПГА,специфичной к антигену, о инкубируют при 3-7 С в течение 20—

30 мин, центрифугируют, переносят

0,5 мл надосадочной жидкости в планшет и определяют антимикробную активность крови по остаточной активности антигена в AF/0,1 РТПГА. 1 табл. кировать активность микробного анти- Я гена, объективного контролирования эффек тивно с ти лечения .

Способ осуществляется следующим ) образом. ©Ъ

В центрифужную пробирку к 0,1 мл ф крови, стабилизированной гепарином из расчета 50 ЕД/мл, добавляют 0,1 мп ар раствора активностью 8,0 и более

АЕ/0,1 РТПГА микробного антигена шигелл Зонне, Ньюкестл или Флекснера, встряхивают, инкубируют при 36-37 С в течение 10-15 мин. Смесь охлаждают 15-30 мин при 3-7 С, К пробам приливают по 0,5 мл раствора иммунной и сыворотки, специфичной к антигену титром 8,0 и более в РПГА. Раствор иммунной сыворотки готовят из 1,0 мл неадсорбированной иммунной сыворотки к шигеллам Зонне, Ньюкестл нли

Флекснера, приложенной для контроль1640652 ных исследований к соответствующему эритроцитарному диагностикуму. С этой целью 1,0 мп сыворотки разводят в 5,0 мл физиологического раствора и для осаждения конгломератов этой сыворотки ее центрифугируют при

3000 об/мин в течение 30 мин. Осадок удаляют, а надосадочный раствор иммунной сыворотки разводят в 100

"00 мл физиологического раствора.

Одномоментно ставят шкалу, позволяющую оценить активность антигена,блокированного исследуемой кровью. К

0,1 мл микробного антигена различной активности с целью уравнивания приливают IIo 0,1 мл Физиологического раствора. Контролем является проба с

0,2 мл физиологического раствора.

К пробам крови с остаточной активностью антигена и различных разведе1 ний этого антигена в контрольных исследованиях приливают по 0,5 мп приготовленного раствора иммунной сыворотки. Пробы встряхивают и инкубиру- 25 о ют при 3-7 С в течение 20-30 мин, центрифугируют 5 мин при 1500 об/мин.

Надосадочный раствор каждой пробы переносят в отдельные лунки 1-го ряда планшета для макроварианта пос- Зн тановки РПГА. В лунки этого ряда и последующих рядов приливают по 0,5 мл физиологического раствора и раститровывают сыворотку каждой пробы по вертикальному ряду лунок naaHmefa, TaK 35 что в 1-й лунке ее разведение будет

2-кратное,.во 2-й — 4-кратное и т.д. до 4-5- ro горизонтального ряда лунок планшета и добавляют в каждую лунку по 0,20-0,25 мл 1 -ной взвеси эритроцитов антигенного диагностикума. С учетом, что при исследовании антимикробной активности крови всегда проводят контрольные исследования, огределяют активность антигена и им- 45 мунной сыворотки — диапазон колебаний времени и инкубации планшетов может быть значителен и составляет соответственно от 2 до 24 ч, температура 5-20 С..

Учет реакции проводят по 4-крестной системе: 4+ ."- все эритроциты агглютинированы и равномерно покрывают дно лунки:

3+ — агглютинированы почти все эритроциты, но на их Фоне имеется малозаметное кольцо иэ осевших неагглютинированных эритроцитов;

2+ — наряду с равномерным агглютинатом на дне лунки имеется осадок из неагглютинированных эритроцитов в виде маленького колечка;

1+ — большинство эритроцитов не агглютинировано и осело в виде маленького колечка в центре лунки.

С учетом, что картина агглютинированных и осевших эритроцитов в лунках четкая, при оценке результатов исследований между 4+ и 3+, 3+ и 2+ дополнительно выделяют 3,5+ и 2,5+.

Иежду 2+ и 1+, 1+ и — соответственно 1,5+ и 0,5+. Такой учет результатов не вызывает трудностей, Однако эта модификация резко повышает точность количественной оценки результатов взаимодействия крови с антигеном.

В дальнейшем кресты, отражающие активность иммунной сыворотки,вступившей в контакт с остаточной активностью антигена в пробах с исследуемой кровью и различными разведениями этого антигена в контрольных пробах с физиологическим раствором различных лунок по вертикальному ряду планшета складывают и получают относительную величину ее активности в +. Из полученных сумм высчитывают остаточную активность иммунной сыворотки в + после ее взаимодействия с исходным раствором, антигена и получают величину активности антигена, блокированного исследуемой кровью или иммунной сывороткой в контрольных пробах в + или АЕ/0,1 в РТПГА.

С учетом, что в микробиологии активность антигена оценивается в основном в АЕ в РТПГА, оценку активности крови можно проводить по формуле

С х Ая.

А

С где A4 — активность антигена в АЕ/ /1,0 мл в РТПГА, блокированного исследуемой кровью; С вЂ” остаточный титр иммунных антител после взаимодействия с антигеном в пробе с кровью в +;

A< — исходная активность микробного антигена в АЕ;

С вЂ” исходный титр иммунных антител в +;

Способ иллюстрируется следующими примерами.

1640652

П р и и е р 1. Влияние дибаэола на антимикробную реэистентность организма у детей.

Исследование антимикробной активности крови проводили у 13 детей, 5 длительно и часто болеющих, 6-летнего возраста до и после 4-недельного курса лечения дибазолом (иммуностимулятор) в дозе 0,005 1 раз в день в поликлинических условиях по вышеописанной методике с использованием

0,1 мл раствора антигена шигелл

Ньюкестл, активностью 13,5 АЕ/0,1 в

РТПГА.

После инкубации О, I мл крови с антигеном при 37 С в течение 10 мин о пробы охлаждали при 3 С в течение

20 мин, приливали к пробам по 0,5 мл иммунных антител к шигеллам Ньюкестл 20 титром 16/ в 0,5 мл в РПГА. Пробы встряхивали и снова выдерживали при

3 С в течение 20 мин, центрифугиро вали при 1500 об/мин 5 мин и 0,5 мл надосадочного раствора проб перено- 25 сили в планшет для макроварианта постановки РПГА и определяли активность блокированного антигена кровью детей в АЕ/О,1 РТПГА.

Средняя величина активности блокированного антигена кровью детей до лечения составляет 3,1 АЕ/0,1 в

РТПГА. Однако отмечаются значительные индивидуальные вариации этого

35 показателя — в диапазоне от 1,0 до

4,0 АЕ С + 16 = 3,1+0,9 (36 = «4-0,27).

После проведенной терапии дибазолом отмечается статистически достоверное повышение уровня антимикробной актив- 40 ности крови у детей (P (0,05), на

+32X. В то же время установлена.обратная зависимость между исходными величинами антимикробной активности крови у детей и изменениями их уров- 45 ней после лечения дибаэолом (r =

= -0,88 + 0,07, P(0,01).

Таким образом, результаты исследований позволяют объективно контролировать эффективность лечения и прог- 5р нозировать изменения индивидуального уровня антимикробной резистентности организма у детей: с относительно низкими исходными уровнями антимикробной активности крови (3,0 АЕ и ниже) 55 отмечается значительное повышение ее уровня и, наоборот, с высокими (3,5 АЕ,и выше) отмечается незначительное повышение, изменение не выявляется или отмечается неэначитель ное снижение этого показателя крови.

Заявляемый способ позволяет с вы-:,, сокой достоверностью прогнозировать уровень изменения антимикробной резистентности организма конкретного ребенка до начала лечения, что позволяет обеспечить индивидуальгчй подход при проведении терапии иммуностимуляторами в поликлинических условиях и проводить объективный контроль за эффективностью лечения.

Л р и м е р 2, Изменение антимикробной реэистентности организма у детей под влиянием лечения липамидом и поливитаминами.

Обследована группа детей в возрасте 3-х лет (17 человек) из дома ребенка М- 1 r. Перми. Особенность этой группы — дети закрытого коллектива с энцефалопатиями смешенного генеза.

Исследование антимикробной активности крови проводили до ипосле лечения поливитаминами и липамидом в -течение 2-х недель по вышеописанной методике с использованием антигена шигелл Ньюкестл активностью 10 AE/

/0,1 мл в РТПГА. После взаимодействия О,1 мл крови с антигеном диаго ностикума при 36 С в течение 15 мин смесь охлаждали при 7 С в течение о

30 мин, приливали 0,5 мл иммунной сыворотки шигелл Ньюкестл титром 16 в

0,5 РПГА,. пробы встряхивали и дополнительно выдерживали при 7 С в тече0 ние 30 мин, центрифугировали при

1500 об/мин в течение 5 мин,надосадочный раствор проб переносили в планшет и определяли активность блокированного кровью антигена в АЕ/О,I

РТПГА.

Средняя величина блокированного антигена кровью детей до лечения составляет 3,3 АЕ, индивидуальные величины этого показателя .колеблются от

2,0 и 4,5 AE. M+6 = 3,3 + 0,9 (3 =

= 0,27) ° После проведения лечения отмечается статистически достоверное повышение уровня антимикробной активности крови у детей (P40,05), на

+ 277. В то же время установлена об-. ратная зависимость между исходными величинами антимикробной активности крови у детей и изменениями их уров» ней под влиянием лечения (r .-0,55 +

0,18, P(0,05), что позволяет,как и в первом примере, проводить объективный контроль за эффективностью лече1640652 ния и прогнозировать изменения антимикробной реэистентности организма под влиянием лечения детей липамидом и поливитаминами: с относительно низкими уровнями антимикробной активности крови (3,5 AE и ниже) отмечается, как правило, значительное повышение ее уровня и, наоборот,при высокой исходной величине антимикробной активности крови (4,0 АЕ и выше) из 6 детей только у одного ребен-. ка отмечается повышение этого показателя,,у двух детей изменений не выявлено, а у трех — наблюдается сниже- 15 ние его уровня.

Приведенные результаты исследований антимикробной активности крови у детей под влиянием лечения липами- дом и поливитаминами убедительно показывают возможность проводить объективный контроль за эффективностью лечения и прогнозировать ее изменение.

Пример 3. Изменение антимикробной резистентности организма у 25 детей под влиянием лечения в санатории "Светлана" ." г.Перми.

Обследована группа детей (27 человек) в возрасте от 3 и 7 лет до начала лечения и в динамике через

4 недели после лечения в детском санатории "Светлана" г. Перми с использованием методики исследования антимикробной активности крови. К О,1 мл крови приливали 0,5 мл антигена шигелл Ньюкестл активностью 16 АЕ/0,1 мл

15 в РТПГА. Пробы выдерживали 13 мин при

36,5 С, охлаждали при 5 С в течение

25 мин, приливали по 0,5 мл иммунной сыворотки к шигеллам Ньюкестл титром 4

16 АЕ/0,5 в РПГА, пробы встряхивали, снова выдерживали при низкой температуре (5 С) в течение 25 мин.Пробы центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 мин, надосадочную жидкость в количестве 0,5 мл переносили в планшет и определяли активность блокированного антигена исследуемой крови в АЕ/0,1 мл в РТПГА.

Средняя исходная величина активности блокированного антигена кровью у детей до начала лечения составляет

4,6 АЕ, индивидуальные колебания этой величины равняются в диапазоне от 2,0 до 9,0 AE И+6 4,6Ы,7 (36 =

+5,1). Через 4 недели после лечения отмечается статистически достоверное повышение уровня антимикробной активности крови у детей (Р<0,05) на +39K. В то же время отмечается обратная зависимость между исходными уровнями антимикробной активности крови доноров и изменения этих величин после лечения (r = †.0,56Ж,13, Р (0,05).

Результаты исследований позволяют сделать вывод о возможности объективного контроля за эффективностью лечения детей в санатории и прогнозирования индивидуальных изменений антимикробной активности крови с использованием заявляемого способа: из

12 детей с относительно низкими уровнями антимикробной активности крови (4,0 АЕ и ниже) у 10 отмечается значительное повышение ее активности и только у 2 не выявляется существенное изменение этого показателя и, наоборот, у 15 детей со средними и высокими уровнями антимикробной активности крови (4,5 АЕ и выше) у

4 отмечается снижение, у 3 существенных изменений не выявлено, у 8 детей отмечается несущественное повышение этого показателя.

Как было отмечено вьппе, при исследовании антимикробной активности крови в качестве стабилизатора использоваяи гепарин в дозе 50 АЕ/мл крови, при снижении дозы препарата до 20—

30 АЕ/мл у ряда здоровых доноров и детей отмечалось частичное свертывание крови. Достаточным является объем

0,1 мл крови, снижение его до 0,05 мл снижает воспроизводимость способа.

Активность антигена шигелл Зонне, Ньюкестл или Флекснера ЛНИИВС составляет 8,0 и более АЕ/О,1 мл в

РТПГА.

В этой дозе антиген полностью блокирует активности гуморальных и клеточных антимикробных факторов цельной крови и частично сохряняет свою активность в отношении индикаторной дозы иммунной сыворотки, используемой для определения активности антигена, блокированного кровью.

Оптимальная температура инкубации крови и антигена составляет 36-37 С.

Основанием для использования этой температуры обработки смеси является энергозависимость процесса взаимодействия крови с антигеном,косвенным доказательством которой является снижение величины блокированного антигена цельной кровью при 3-18 С.

1640652 10

Для выявления индивидуальной разницы антимикробной активности исследуемой крови оптимальное время обработки смеси составляет 10-15 мин.

Увеличение времени инкубации снижает эту разницу. Этот эффект связан иммуностимулирующими свойствами индикаторной дозы антигена в отношении активности антимикробных факторов крови. В связи с этим при увеличении времени обработки смеси при 37 С более чем 15 мин резко снижается индивидуальная разница в антимикробной активности крови у доноров или детей.

Результаты исследований полностью подтверждают литературные данные о возможности некоторых микробов и их субстанций (БЦЖ и липополисахаридов) 20 стимулировать активность клеточных факторов иммунитета.

После взаимодействия крови с антиО геном пробы охлаждают до 3-7 С. В литературе известны данные, полученные на модели исследования фагоцитар- ной активности лейкоцитов, что при низкой температуре отмечается снижение и даже полное прекращение метаболических процессов в клетках крови, 30 следствием которого является угнетение или полное прекращение антимикробной активности этих клеток. В то же время сохраняется способность антигена вступать во взаимодействие с иммунными антителами, используемая для индикации остаточной активности этого антигена.

В результате исследований установлено, что индикаторная доза иммунных 40 антител в титрах при определении остаточной активности антигена в пробах с кровью составляет 8,0 и более в 0,.5 мл в РПГА. Время контакта при

3-7 С антигена с иммунными антитела- 45 ми достаточно 20-30 мин. Как показали исследования, к этому сроку наблюдается полная блокада активности антигена иммунными антителами в пробах с кровью. 50

Для определения неспецифической антимикробной активности крови использованы взвеси микробов шигелл

Зоине, Ньюкестл и члекснера или взвеси антигенных эритроцитарных диагнос- тикумов из этих микробов. Основанием для использования антигенов дизентерийной группы микробов являются полученные с использованием заявляемого способа результаты исследований: прямая корреляционная связь между индивидуальными уровнями антимикробной активности крови к этой группе микробных антигенов.

Несмотря на значительные индивидуальные колебания антимикробной активности крови к антигенам шк -елл

Зонее> Ньюкестл отмечается высокая прямая корреляционная связь между уровнями активности блокированного антигена этих микробов (г = +0,95+

+ 0,04 Р(0,01).Аналогичная прямая корреляционная связь выявлена между уровнями антимикробной активности крови доноров к антигенам шигелл Зонне и флекснера, шигелл Ньюкестл и

Флекснера (Р(0,05).

Преимущества способа определения антимикробной активности крови по ее способности блокировать активность микробного антигена заключаются прежде всего в том, что эта методика отражает интегральный результат взаимодействия крови с антигеном — позволяет оценить способность гуморальных и клеточных компонентов крови снижать активность микробного антигена. Показатель антимикробной активнос", ти цельной крови на 4/5 состоит из величины блокированного антигена гуморальным компонентом крови, около

1/5 приходится на клеточные элементы крови — эритроциты, лимфоциты,фагоциты. Величина фагоцитированного антигена в антимикробной активности крови составляет не более 5Х ° В то же время методика оценки фагоцитаРной активности лейкоцитов отражает, как правило, уровень фагоцитоза 100200 поли- и мононуклеарных фагоцитов.

Заявляемый способ отличается высо-, кой точностью — средняя ошибка не превышает 5Х, высокой воспроизводимостью, составляющей практически

100Х в сравнении с методикой оценки фагоцитоза,которая по мнению больi шинства исследователей в фазе подсчета имеет ряд недостатков: субъективна, недостаточно точна и воспроизводима.

Важным преимуществом заявляемого способа является и высокая производительность труда. Для оценки результатов исследований требуется не более i мин. Для подсчета в 1 мазке ко" личества объектов, Фагоцитировакных

1640652 дуется в практическую медицину для объективного контроля за эффективностью лечения лекарственными препаратами, обладающими иммуностимулирующими свойствами, и другими способами лечения,прогнозирования неспецифической антимикробной резистентности организма.

Формула изобретения

Способ определения

Показатели фагоцитарной активности антимикробной активности лейкоцитов (прототип) цельной крови

Способ отражает антимикробную активность антител (BOX), эритроцитов (15X) и не более 57 приходится на долю фагоцитов

100-200 поли- и мононуклеарных фагоцитов ошибка составляет не более 5Х

Точность

Воспроизводимость

Производительность низкая практически 100 не более 1 мин низкая для подсчета количества объектов фагоцитоза в 100-200 лейкоцитах требуется около

30 мин — 1 ч требуются

Растворы для фиксации окраски мазков нет

Составитель П.Бонарцев

Техред С,Мигунова Корректор JI,Áåñêèä.Редактор И.Шубина

Заказ 1264 Тираж 417 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям пру ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина,101

100-200 лейкоцитами, необходимо около 30 мин — I ч.

В заявляемом способе не требуются растворы для..фиксации и покраски маз5 ков.

Сравнительная оценка различных способов определения антимикробной реэистентности организма показана в таблице. 10

Заявляемый способ может конкури" ровать по точности исследования антимикробной резистентности с радиоиммунными методами. Однако в нем не требуется меченых радиоактивным иэо. топом микробных взвесей. Определение антимикробной активности цельной крови проводится с использованием стандартизованных, доступных, выпускае- 20 ,мых отечественной промьппленностью микробных антигенов дизентерийной группы микробов и прилагаемых к ним

) иммунных сывороток.

С учетом высокой точности,объективности, высокой воспроизводимости и производительности труда при исследовании антимикробной реэистентности организма заявляемый способ рекомен-, Способ определения микробной реэистентности организма путем внесения в пробу цельной крови микробного антигена с последующей оценкой результатов взаимодействия компонентов крови с антигеном, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью упрощения и повышения точности способа, в пробу цельной крови вносят антиген с избыточной активностью, инкубируют, затем вносят специфические к антигену иммунные антитела, повторно инкубируют с последующим центрифугированием смеси, отделением надосадочной жидкости и определением в ней остаточной активности внесенного антигена в реакции торможения пассивной гемагглютинации.