Способ получения конъюгата авидина с коллоидным золотом

 

Изобретение относится к анализу биологических материалов с использованием биотиновых меток и может быть использовано в гибридизационном анализе нуклеиновых кислот, иммуноанализе и исследовании биологического материала с помощью электронной микроскопии. Целью изобретения является улучшение качества целевого продукта за счет увеличения его стабильности. Способ заключается в присоединении авидина к коллоидному золоту при обработке золя золота 20-200-кратным мольным избытком авидина с последующим отделением несвязавшегося авидина, при этом перед присоединением авидина золь стабилизируют сывороточным иммуноглобулином G при соотношении 30-100:1 с отделениемнесвязавшегося иммуноглобулина, а авидин активируют обработкой 1-16%-ным раствором глутарового альдегида, после присоединения авидина его закрепляют в конъюгате обработкой 0,002-0,02 М раствором боргидрида натрия. Использование предлагаемого способа позволяет улучшить качество целевого продукта за счет увеличения его стабильности в 7-9 раз, а также повышения чувствительности визуализации с использованием целевого продукта в 10 раз. 2 табл. fcrf fe а со со сь со

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

I

1 вю

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

6 (21) 4647105/13 (22) 26,12.88 (46) 30,03,91. Бюл. N. 12 (71) Новосибирский институт биаорганической химии СО АН СССР (72) М.И.Добриков, И,В.Сафронов и Г.B.Шишкин (53) 577.15 (088,8) (56) Mocremans М., 0anneels G., Van Dijck А„

Langarger G. and De Mey J. Sensitive

visualization of antigen antibody reaction in

dot and blot immune overlay assays with

immunogold and immunogold /Silver

staining.— Journal of immunological

methods., 1984, Vol. 74, рр. 353-360.

Toison N.D., Bootroyd В. and Hopkins

СЯ. Cell surfase labelling with gold colloid

particulates the use of avidin and

staphylococcat protein А-coated gold in

conugation with biotin and Fe-bearing

ligands.— Juornal of М1сгозсору, 1981, Vol, 123(2), рр. 215 — 226. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГАТА

АВИДИНА С КОЛЛОИДНЫМ ЗОЛОТОМ (57) Изобретение относится к анализу биологических материалов с использованием

Изобретение относится к области анализа биологических материалов с использованием биотиновых меток и может быть использовано в гибридизационном анализе нуклеиновых кислот, иммуноанализе и исследовании биологических материалов с помощью электронной микроскопии.

Целью изобретения является улучшение качества целевого продукта.. Ж 1638163 А1 (я)5 С 12 N 11/00, G 01 N 33/53 биотиновых меток и может быть использовано в гибридиэационном анализе нуклеиновых кислот, иммуноанализе и исследовании биологического материала с помощью электронной микроскопии. Целью изобретения является улучшение качества целевого продукта за счет увеличения его стабильности. Способ заключается в присоединении авидина к коллоидному золоту при обработке золя золота 20 — 200-кратным мольным избытком авидина с последующим отделением несвязавшегося авидина, при этом перед присоединением авидина золь стабилизируют сывороточным иммуноглобулином G при соотношении 30 — 100:1 с отделением нес вязавшегося иммуноглобулина, а авидин активируют обработкой 1 — 167,-н ы м раствором глутарового альдегида, после присоединения авидина его закрепляют в коньюгате обработкой

0,002-0,02 M раствором боргидрида натрия, Использование предлагаемого способа позволяет улучшить качество целевого продукта засчет увеличения его стабильности в7 — Q раэ, а также повышения чувствительности визуализации с использованием целевого продукта в 10 раз. 2 табл, Способ получения конъюгата авидина (А) с коллоидным золотом (КЗ) заключается в стабилизации золя К3 путем смешивания с водным раствором сывороточного иммуноглобулина Г (ИгГ), отделением несвяэавшегося.ИгГ (например, ультрацентрифугированием или гель-хроматографией) и последующим смешением с авидином; предварительно активированным 1 — 16 $-ным раствором глутарового аль1638163

25

40

50

55 дегида при мольном отношении авидин: КЗ -20-200:1, с последующим закреплением авидина в конъюгате обработкой

0,002 — 0,02 молярным раствором (0,080,8 г/л) боргидрида натрия и отделением несвязавшегося авидина (например, гельхроматографией или ультрацентрифугированием). Чувствительность метода визуализации на его основе составляет

2-3 пг био-ДНК в пробе, а время жизни такого конъюгатэ превышает 7 мес (свойства коньюгата не изменя ются в течение 7 мес с момента его получения). Чувствительность метода визуализации с использованием конъюгата, полученного известным способом, около 20 пг био-ДНК в пробе, а время жизни такого коньюгата 3 — 4 нед.

Пример 1. Получение конъюгата авидина с коллоидным золотом через иммуноглобулин Г.

А. К 60 мл 0,005% золя золота (размер частиц 10 + 2 нм, оптическое поглощение при длине волны 520 нм (Dgzo = 0,8, мольная концентрация 8 х 10 моль/л) в 0,01 M растворе К2СОз при рН 9,5 добавляют при перемешивании 1 мл раствора ИгГ(2,3 мг/мл, отношение ИгГ:КЗ = 30;1) в 0,01 M растворе

К2СОз при рН 9,5 (изозлектрическая точка

ИгГ 7,5). Смесь выдерживают 30 мин и затем добавляют бычий сывороточный альбумин до концентрации 1 мг/мл. Выделение КЗ, стабилизированного ИгГ (И-K3), проводят методом гель-хроматографии.

Б; Присоединение авидина к И-KÇ, К 0,5 мл раствора авидина (2 мгlмл) в 0,1 M

КНСОз при рН 9,0 добавляют 0,05 мл 25%ного раствора глутарового альдегида.

Смесь выдерживают 30 мин и затем наносят на колонку размером 1 х 20 см, заполненную сорбентом "Sephiclex G-50" (Pharmacia, Швеция), уравновешенную 0,1 М раствором

КНСОз рН 9,0. Элюцию ведут в том же буфере со скоростью 20 мл/ч. В данных условиях происходит полное отделение активированного авидина от непрореагировавшего глутарового альдегида. Фракции, содержащие авидин, объединяют и добавляют к 2 мл раствора И-КЗ (Dao = 5,0, отношение авидин:КЗ = 150:1) в 0,1 M КНСОз при рН 9,0.

Через 30 мин добавляют 0,02 M раствор боргидрида натрия до конечной концентрации 0,002 — 0,01 М, Смесь выдерживают 30 мин и затем добавляют бычий сывороточный альбумин до конечной концентрации

10 мг/мл. Выделяют образовавшийся коньюгэт АИ-КЗ методом гель-хроматографии.

Испытания конъюгатов А-КЗ. и АИ-КЗ.

Нитроцеллюлозные фильтры с нанесенной био-ДНК в диапазоне 10 нг — 0,1 пг инкубируют а растворе конъюгата А-КЗ или AN-KÇ (0520 = 0,5) в присутствии О, 1 М К2Н РО4, 5 мг/мл бычьего сывороточного альбумина при рН 7,5 в течение часа. промывают в течение часа в трех сменах раствора 0,1 M

К2НРО4 и 0,1% детергента "Tween-20" и в течение 15 мин в бидистиллированной воде.

После этого проводят физическое серебряное усиление по стандартной методике. Серебряный усилитель (0,077 М гидрохинон, 0,0055 М лактат серебра в 0,2 M цитратном буфере, рН 3,85) готовят непосредственно перед употреблением смешиванием 10 мл концентрированного цитратного буфера (23,5 г тринатрийцитрата дигидрата и 25,5 г гидрата лимонной кислоты на 100 мл воды), 60 мл воды, 15 мл раствора гидрохинона (0,95 г на 15 мл воды) и 15 мл раствора лактата серебра (0,11 г на 15 мл воды). Усиление ведут 20 мин при красном свете, после чего закрепляют изображение в фотографическом фиксаже и отмывают в воде, Затем фильтры высушивают и фотометрируют в отраженном свете на приборе

ДО-1. Достоверным считают сигнал, превышающий на 0,1 оптическую единицу фон (3-кратное превышение паспортной точности измерения прибора ДО-1), а соответствующее этому сигналу количество био-ДНК определяют как чувствительность метода.

Испытания коньюгатов проводят. сразу после получения, через 40 дней и через 200 дней хранения в растворе 0,1 М KzHP04 и 5 мг/мл бычьего сывороточного альбумина при рН 7,5 в холодильнике (4 С). Результаты испытаний приведены в табл. 1.

Пример 2, Подбор концентраций глутарового альдегида (ГА) при обработке авидина.

Опыт проводят так же, как в примере 1.

Изменяют концентрацию ГА при обработке авидина. Испытания полученных коньюгатов проводят, как в примере 1. Результаты представлены ниже:

Пример 3, Подбор отношения авидин:KÇ.

1638163

Опыт проводят аналогично примеру 1, Изменяют отношение авидин:K3. Испытания полученных конъюгатов проводят, как в примере 1. Результаты приведены ниже:

Пример 4. Подбор условий обработки боргидридом натрия, Опыт проводят, как в примере 1. Изменяют концентрацию боргидрида натрия.

Испытания проводят, как в примере 1. Ре- 20 эультаты представлены в табл. 2.

Пример 5, Влияние соотношения

ИгГ:КЗ на чувствительность визуализации с использованием этого конъюгата приведено ниже: 25

При ИгГ:КЗ < 6 золь неустойчив и легко коагулирует при уменьшении рН или добавлении соли; при ИгГ;КЗ = 6 — 30 комплекс устойчив к указанным воздействиям, но 40 частицы КЗ еще способны сорбировать дополнительные порции молекул иммуноглобулина Г (ИгГ); при соотношении

ИгГ:КЗ 30 поверхность частиц КЗ насыщается и последующие порции ИгГ остают- 45 ся в растворе, т.е. образуется стабильный комплекс постоянного состава. Для получения .конъюгата важным является именно стабильность по составу получаемого комплекса иммуноглобулина Г с ко .лоидным зо- 50 лотом, Использование именно такого стабилизированного комплекса для получения конечного конъюгата давало наилучшие результаты. При использовании комплекса, который не подвергался стабилизации по составу (т.е, при соотношении ИгГ:КЗ < 30), конъюгаты получались с более низкой чувствительностью.

Перед связыванием с глутарированным авидином комплекс иммуноглобулина

Г с коллоидным золотом отделяется от избытка молекул ИгГ, не связавшихся с К3.

Соответственно в реакцию вступает стабилизированный комплекс ИгГ-КЗ и эффективность реакции определяется соотношением авидин;ИгГ-К3, численно равным приведен- ному соотношению авидин:коллоидное золото (20-200: 1), Для стабилизации золя КЗ могут быть использованы ИгГ из сыворотки быка, человека и в основном лошади (как наиболее дешевый). Все они дают целевые коньюгаты авидина с КЗ с одинаковыми свойствами, Использование ряда других белков (все они дают менее прочные комплексы с K3) приводит к получению коньюгата авидина с

К3 с гораздо более низкой чувствительностью (опыты проводят аналогично примеру

1, только вместо ИгГ используют бычий сывороточный авидин, овальбумин и цитохром С).

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет получать конъю- . гаты авидина с К3 улучшенного качества.

Так, чувствительность визуализации биотинсодержащих веществ возрастает в 10 раз (до 2 — 3 пг вместо 20 пг), а стабильность — с 3 — 4 нед до 7 мес.

Формула изобретения

Способ получения конъюгата авидина с коллоидным золотом, включающий обработку золя коллоидного золота 20 — 200-кратным MollApHblM избытком авидина и отделение несвязавшегося авидина, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью улучшения качества целевого продукта, перед обработкой авидином эоль коллоидного золота стабилизируют водным раствором сывороточного иммуноглобулина Г при соотношении иммуноглобулина и коллоидного золота 30 — 100:1 с последующим отделением несвязавшегося иммуноглобулина, авидин предварительно активируют

1-16;Д-ным глутаровым альдегидом, а после обработки золя авидином конъюгат инкубируют в присутствии 0,002-0,02 M раствора боргидрида натрия, 1638163

Таблица 1

Таблица 2

Составитель В.Муронец

Редактор О.Спесивых Техред M.Моргентал Корректор И.Эрдейи

Заказ 901 Тираж 378 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул, Гагарина, 101