Способ получения бычьего гормона роста

 

СОЮЗ COBETCHHX

ЩСГ1УЬЛИК

O9l (11) (gl)g С 12 N 15/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПРИ П4НТ СССР „ /

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ I (21) 4027045/13 (22) 21.02.86 (31) 704362 (32) 22.05.85 (33) US (46) 30.04.91. Бюл. И 16 (71) Монсанто Компани (US) (72) Гвен Грабовский Криви (US) (53) 575.224.2:577.2(048/088.8) (56) Proc. Nat>1 Acac :, Sci, USA, 81, р. 5403-5407. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЬ1цЬЕГО ГОРМОНА РОСТА (57) Изобретение относится к генетической инженерии и касается полуИзобретение относится к генетической инженерии и касается получения рекомбинантного бычьего гормона роста.

Пель изобретения — повышение биологической активности бычьего гормона роста в отношении стимуляции лактации у коров.

Бычий гормон роста получают пу-тем конструирования рекомбинантной плазмидной РНК, кодирующей бычий гормон роста, в результате выделения кПНК иэ плаэмиды рГН „ -I встраивания кодона для аланина вслед за ATG кодоном, реклонирования в плазмиду р Ъ ГН -I, трансформации полученными рекомбинантными ЛНК штаммов E.coli с последующим выделением и очисткой конечного продукта.

2 чения рекомбинантного бычьего гормона роста. Пель изобретения — повышение биологической активности бычьего гормона роста в отношении стимуляции лактации у коров. Бычий гормон роста получают путем конструирования рекомбинантной плазмидной РНК кодирующей бычий гормон роста в результате выделения ДНК из плазмиды рГН -I, встраивание кодона для аланина вслед за АТГ кодоном, реклонирования в плаэмиду рВГН „-Т, трансформации полученным ЛНК штаммов E. coli с последуюп лм выделением и очисткой конечного продукта. 1 э.п. ф-лы, 3 табл.

Пример 1. а) Кодирующую соматотропин, т. е. бГР (Л) последовательность РНК выделяют иэ рГН „ -I KaK фрагмент

Хва? и клонируют в сайт ХваХ модифицированного вектора M13mp8 (М13шр8/

/XaaI). Хва? рассекает в обоих кон- цах кодирующую бГР (Л) последовательность РНК, "вырезая" таким образом полную кодирующую бГР (Л) последовательность. Ллаэмиду рВГНек -I после обработки ферментом I смешивают в присутствии ЛНК-лигазы Т4 с РФ

ДНК (РФ вЂ” репликативная форма вектора) М13шр8/Хва?, линеаризо:ванной при помощи эндонуклеазы рестрикции ХваТ, и обрабатывают щелочной фосфатазой иэ кишечника теленка (крупного рогатого скота). Затем смесь инкубируют в течение ночи при

1646489

14 С. Обработка щелочной фосфатазой из кишечника теленка (крупного рогатого скота) предотвращает рециркуляризацию вектора И13тпр8/ХваТ. Вставку кодирующей бГР (Л) последовательности РНК в вектор M13mp8/ХваТ с целью образования рекомбинантного вектора

M13mp8/ВСН „-I первоначально контролируют образованием бесцветных бляшек на культуре бактерий IM101 Е. coli, выращиваемой на среде 1 х УТ, используя процедуру покрытия мягким агаром, который содержит 10 мл 100 MM

ИПТГ (изопропил-)-П-тиогалактопиранозида) и 50 мкл 2Х (в/о) Х-GAL (5бром-4-хлор-3-индолил- -D-галактопиранозида) в 3 мл верхнего arapa, и осуществляют трансфекцию упомянутым рекомбинантным вектором аналогично описанному. Вставку кодирующей бГР(Л) последовательности подтверждают при помощи рестрикции изолированной РФ

ДНК рекомбинантного вектора ферментом ХваТ, в результате чего получают 25 фрагмент в 590 пар оснований, содержащий вставленную последовательность.

Фрагмент в 590 пар оснований идентифицируют при помощи электрофореза на агаровом геле в однопроцентном агаре. Все последующие фрагменты после обработки ферментами идентифицируют именно .при помощи этой процедуры, Ориентацию вставленных кодирующих бГР (Л) последовательностей контролируют при помощи обработки

РФ рекомбинатного вектора ферментами SmaI u Hind III. Если кодирующие последовательности находятся в правильной 5 -+ 3 ориентации, в резуль- 40

I тате сечения этими ферментами рестрикции получают фрагмент в 207 пар оснований. Осуществляют изоляцию .однонитевой (ОН) РНК фага, вектор

М13шр8/ВСНе -Т используют в качестве 45 матрицы прй сайт-специфическом мутагенезе, Олигонуклеотидную затравку, содержащую последовательность для искомой мутации, используют для эатравления синтеза конии замкнутой кольцевой ПНК матрицы M13mp8/ВСН -I онРНК. Полученные таким образом замкнутые кольцевые молекулы двунитевой (PH) ДНК отделяют от неполных колец и колец онДНК при помощи центрифугирования градиентом щелочной сахарозы. Замкнутые кольцевые молекулы днДНК используют для трансформации

Е. coli IM10 1 и полученные в результате бесцветные бляшки помещают на фильтры Пэлл и просеивают, контролируют гибридизацию в меченную Р форму олигонуклеотидной затравки, использованной для осуществления сайт»специфического мутагенеэа. Фильтры промывают при увеличивающихся температурах до тех пор, пока не исчезнет радиоактивно меченный сигнал с контрольного фильтра, который приготавливают с использованием фага ЮЗтр8/

/ВСНе Те Промывку фильтров осуществляют при комнатной температуре в б х SSC (0,9 M NaC1 0,09 M цитрата натрия) в течение 10 мин, затем при

50 С в 6 Х SSC в течение 5 мин, а последующие промывки — при увеличении температуры на 5 С. Бляшки, которые о гибридизировались с образованием меченной радиоактивным элементом олигонуклеотидной затравки при температурах более высоких, чем контрольные фаги, считают несущими новую ссз,данную кодирующую бГР (Л,Л) последовательность и называют положительными. Отдельные бесцветные бляшки отбирают из культуры трансформированных клеток IM101 E. coli и выращивают.в 5 мл среды 2 х УТ (1,6Х (в/о) триптона, 1,0Х (в/о) экстракта дрожжей, 0,5Х (в/о) NaClj в течение ночи при 37 С в условиях аэрации. РНК фага затем наносят пятнами на нитроцеллюлозу, подвергают гибридизации с затравкой, меченной радиоактивным элементом, и промывают при увеличении температуры, как указано вьппе.

ДНК фага, которые имели температуру гибридизации вьппе контрольных бляшек

M13mp8/ÂGH -I, являются потенциально положительными.

Потенциально положительные бляшки из обеих процедур выращивают и используют для получения онДНК фага, анализируют последовательность онДНК, чтобы подтвердить, что она действительно несет кодирующую бГР (А,Л) последовательность. РФ PHK M13mp8/

/ВСН „-Т (аlа) тоже анализируют, отбирают при помощи анализа ферментом рестрикции Нае III с тем, чтобы убедиться в присоединении кодона аланина после комплекса сигналов начала кодон метионина АТГ, так как при создании кодона аланина образуются дополнительные сайт-ограничения

Нае III, частота присоединения кодона

5 164 аланина составляет примерно 27. кодирующей .бГР (Л) последовательности

ДНК. б(Конструкцию кодирующей бГР (А,В последовательности ДНК отбор и анализ последовательности осуществляют аналогично описанному, но матрицей является N13mp8/ВСНеХ-Т (аlа), а олиго клеотидная затравка указана в табл. 1.

Частота превращения кодона лейцина в кодон валина составляет примерно 10Х.

В табл. 1 показано конструирова. ние кодирующих соматотропин с K-концевым аланином последовательностей.

- в) Конструкцию кодирующеи бГР (В) последовательности ДНК отбор и анализ последовательности проводят аналогично описанному. При этом матрицей является М13тпр8/ВСН „-I, а олигонуклеотидная затравка используется та же, что и при конструировании бГР (А,В). Частота превращения кодона лейцина в кодон валина составляет .примерно 107., Используют олигонуклеотидный сайтспецифический мутагенез, чтобы присоединить кодон аланина к кодирующей сГР (Ф) последовательности ДНК.

Коднрующую сГР (Ф) последовательность ДНК s 590 пар оснований, содержащуюся на плазмиде РРСНех-I, выделяют из этой плазмиды при помощи эндонуклеазого сечения EcoRI иНiпй III которые рассекают плазмиду в 5 -и 3 а концах кодирующей сГР (Ф) носледовательности. Рассеченную плазмиду рРСН -I смешивают с РФ РНК N13mp9, который разрезают эндонуклеазамн

EcoRI u Hind III и предварительно обрабатывают щелочной фосфатазой из кишечника теленка (крупного рогатого скота) с тем, чтобы предотвратить повторную лигацию фрагментов рестрик-ции N13mp9. Затем в упомянутую смесь добавляют РНК-лигазу Ò4. Благодаря наличию отклоняющихся от нормы концов на РФ ДНК фага и кодирующей гГР (Ф) последовательности ДНК образованных при использовании, двух различных ферментов рестрикции, ДНК сГР (Ф) селективно вставляют в РФ

ДНК фага в правильной. 5 ->3 ориентаj t ции. Затем осуществляют трансформацию E. coli IN101 в соответствии с описанием, приведенным выше для М13шр8/ВСН !,-I при помощи рекомбинантного вектора М13тпр9/РГН „-Т, не- сущего кодирующую сГ" (>) последо6489

6 вательность ДНК. Затем трансформированные Е. coli ТМ101 выращивают на среде 1 !а УТ, содержащей колориметрические реагенты, и отбор осуществляют по образованию бесцветных бляшек аналогично описанному.

Вставку кодирующих сГР (Ф) послену-довательностей НК подтверждают следующим образом. Выбирают бесцветные бляшки, а РФ ДНК N13mp9/PCHe!!-I рассекают эндонуклеазами EcoRI иНхпй ЕТТ и подвергают электрофорезу на агаровом геле, в результате чего получают фрагмент в 590 пар оснований, содержащий вставленную ДНК с ГР (Ф). Затем фаг М13шр9/РГН „ -I размножают в Е.co1i IN101 выделяют онПНК фага. ,!!НК М13!нр9/РСНех Т используют s качестве матрицы для сайт-.специфического мутагенеза, как описано выше, конструирования кодирующей бГР (А,Л) последовательности, используя специальную затравку (табл. 1) . Частота

25 присоецинения кодона аланина, в данном случае ГСС, к кодирующей сГР (Ф) последовательности, составляет примерно 12Х. Получение кодирующей сГР (А) последовательности.опдтверж-

30 дают анализ последовательности рНК

Пример 2. Получают три олипептида, соматотропины видов бГР (А, Л), бГР (A,В) и сГР (А).

Кодирующие бГР (А,Л), бГР (А,В) и бГР (В) последовательности ДНК, содержащиеся на рекомбинантных вектоРах М13тРЯ/ВСРех-Т (аlа), N13mp8/Â|".-Íe!,-Т (ala, val) и М13шр8/

/Всех-I (ча1), соответственно исноль40 зуют для замены кодирующей бГР (Л) последовательности,ПНК, содержащейся на плазмиде экспрессии рВГН -Т. ех

Это осуществляют при помощи переваривания соответствующих РФ ДНК М13

45 ферментом ХваТ. Плазмиду экспрессии рВ .- Не„-I переваривают эндонуклеазой

ХваТ, а затем обрабатывают щелочной фосфатазой из кишечника теленка (крупного рогатого скота) с тем, что50 бь! Предотвратить повторную rag фрагментов рестрикции. Каждую из переваренных P@ PHK смешивают с переваненой 7 НК рВГН „-I и подвергают лигации в течение ночи при 14 С..

5.

Полученные таким образом рекомбинантные векторы экспрессии, которые обозначают рМОИ 3209, pNON 3215 и pNON

32 14, несут кодирующие бГР (А,Л), бГР (A,В) и бГР (В) последовательнос1646489 ти ДНК соответственно. Затем Е. coli V 3110 подвергают трансформации ,смесью, содержащей pMON 3209 или рМ011 3215, или pMON 3214, или

pBCF

Лауриа (БЛ), содержащем 17 (в/о) триптона, 0,57 (в/о) экстракта дрожжей и 0,57, (в/о) NaC1, а также

12,5 мкг/мл тетрациклина и 200мкг/мл ампициллина. Штамм Е, соli W 3110 с плазмидой pNON 3209 задепонирован под номером АТСС 53024„ Штамм Е. coli W 3110 с плазмидой pNON 3215 задепонирован под номером АтСС 53022.

Трансформацию осуществляют следующим образом. Приблизительно 50 мл культуры E. coli W 3110 выращивают в среде BJI до ОП600=0,60. Клетки извлекают в виде таблетки и вновь суспендируют в 10 мл буфера А, содержащего 25 MY трис, рН 7,6, и .10 мР НаС1.

Затем клетки извлекают в форме таблетки и вновь суспендируют в 1 мл буфера А, в который добавляют 14 мл . 2S буфера В,. содержащего 25 мИ трис, рН 7,6, 10 мМ ИаС1, 50 мМ СаС1, и суспензию инкубнруют на льду в течение 30 мин. Далее клетки извлекают в hoyMe таблетки и вновь суспендиру- 30 ют в 3 мл буфера В. Порцию в 0,2 мл суспендированных клеток вновь смешивают с О, 1 мл буфера В и 0,1-0,5 мкг рекомбинантным вектором экспрессии (pM0N 3209. или pNÎN 3215, pNÎN 3214 или ВГИе -Х) и инкубируют на льду в течение 60 мин. Затем инкубированную смесь нагревают на 1 мин при

37 С, после чего добавляют 3 мл среды БЛ. Далее полученную в результате 40 смесь инкубируют в течение 60 мин при 37 С. Клетки извлекают в форме таблетки и вновь суспендируют в

300 мп среды БЛ и выращивают на пластинках с БЛ, содержащих вышеназван- 45 ные антибиотики. Далее отбирают стой кие колонии и выделяют ДНК векторов экспрессии рИОН 3209, рИОИ 3215, РВСН „-I и pN01 3214 ° PHK pMON 3209, pMON 3215, рВГPex I и рИОН 3214 анализируют на наличие фрагмента Хва? в 590 пар оснований и фрагмента

Find III/Smal в 200 пар оснований, подтверждающих наличие кодирующих бГР (А,Л), бГР (В) и бГР (А,В) последовательностей ДНК в правильной ориентации. Далее плазмиды экспрессии

pNON 3209 и рИОИ 3215 анализируют при помощи анализа эндонуклеазами рестрикции (Нае III) с тем, чтобы убедиться в присутствии нового сайта

Нае III, образовавшегося при присоединении кодона ГСС (аланина). Фрагмент Xaal в 590 пар оснований из векторов pMON 3209, pNON 3214 и pNON 3215 анализируют на состав последовательности с тем, чтобы подтвердить присутствие в этих векторах экспрессии кодирующих для бГР (А,Л), бГР (В) и бГР (А,В) последовательностей ДНК.

Отдельные колонии Е. coli W 3110, несущие нлазмиды pNON 3209, рИОИ 32149

ВГН@,-I или pNON 3215, помещают в

5 мл БЛ, содержащего f2,5 мкг/мл тетрацнклина, и выращивают в течение ночи при 37 С при аэрации, После че-. го 0,5 мп каждой культуры используют для выращивания отдельно на 25 мл среды N9 содержащей (на 1 л среды)

100 мл солей (70 r Na PPO 30 г

КН РО4,, 5 г БаС1, 10 r ИР4.С1 на

1000 мл общего объема), 1,2 -мл 1 N раствора Ng804. 0,25 мл О, 1Х-ного В, 12,5 мл 2ОХ-ного (в/о) раствора глюкозы, 0,025 и 1 N раствора СаС1 дополненной 0,5Е (в/о) казаминовйх кислот и 6,25 мкг/мл тетрациклина и содержащейся s 250-миллиметровой колбе. Каждую культуру. выращивают при 37 С в условиях аэрации до тех пор, пока ОП600 (оптическая плотность в диапазоне 602 нм) не достигнет

1,0. Далее.0,2 мл извлекают из каждой упомянутой колбы и отдельно подвергают лнзированию в буфере додецилсульфатнатрия (ДСН) полиакриламидного гелевого электрофореза (ПАГЭ) и и анализируют методом ДСН-ПАГЭ. Протеины с молекулярным весом 22000 дальтон в высоких концентрациях получают в культуре Е. coli W 3110 для обеих генетических конструкций, Клетки культуты Е. coli W 3110, несущие нлазмиду pBR322, не продуцируют протеин в 22000 дальтон, который связывается с антителами антисоматотропина.

Бактерии, несущие плазмиды рМОИ

3209, pNON 3214, рВГН -I и pMON 3215, хранят следующим образом. Каждую колонию культуры Е. coli W 3110, трансформированную при помощи только одной плазмиды (pMON 3209 или

pMON 3215, pNON 3214 или pBGF.ex-Т), о выращивают в течение ночи при 37 С в 5 мл БЛ плюс 12,5 мкг/мл тетрациклина при аэрации. Порцию в 1 мл каж9 1646489 10 дой культуры после выращивания в те чение ночи добавляют отдельно в индивидуальные колбы, содержащие 25 мл

БЛ плюс 12,5 мкг/мл тетрациклина и выращивают до достижения ОП600 1,0.

Затем клетки из каждой колбы собирают центрифугированием при ускорении 6000 х g при 4 С в течение 5 мин таблетки. Отдельно суспендируют снова в 12 мл БЛ плюс 7 5Х (в/в) ДИСО и очень быстро замораживают на сухом льду порциями.в 1 мл. Далее клетки хранят в холодильнике с жидким азотом. 10 мкг очищенной ДНК плазмнды хранят при -80 С.

Кодирующую сГР (А) последовательность, содержащуюся на рекомбннантном векторе М13ар9/PGPex I (ala), используют для того, чтобы .заменить кодирующую бГР (Л) последовательность ДНК, содержащуюся на модифицированном векторе экспрессии РВСН -Х, Модифицированный вектор экспрессии

pBCHex -I. является вектором эксх прессии РВСН х-I, в котором сайт ограничения EcoRI, расположенный вверх от промотора триптофана (ptr p), . удален. Модифицированный вектор -экс прессии РВСНех-Х констРУируют пРИ. помощи частичйого переваривания ферментом EcoRI РВСН „-I с последующей обработкой нуклеазой ЯХ с тем, чтобы удалить липкие концы, Вектор

РВСН -Х после рестрикции подвергаех 35 ют рециркуляризацин с использованием

I ДНК-лигазы Т4, а затем используют для трансформации культуры Е. coli ЛИ01. Все зто осуществляют в соответствии с описанным ранее Д"К 40 нлазмиды из каждой колонии анализи,руют на наличие фрагмента EcoRT/

/Hind IIX в 590 пар оснований, несущего кодирующую сГР (А) последовательность, н ФРагмента Есор/ 45

/PPat I в 1050 пар оснований, несущего последовательность ptr р. удаление этого EcoRI сайта рестрикции упрощает сайт-специфическую вставку специального сайта кодирующей. сГР (А) последовательности в вектор экспрес50 сни РВСН х-Х в правильной ориентации, Рекомбинантный вектор экспрессии, полученный таким образом, в дальнейшем обозначают pMON 3213. Смесь, содержащую pN0N 3213, используют для трансформации культуры Е. col i W 3110 затем трансформированные клетки выращивают и подвергают селекции:Культура E. coli W 3110, содержащая

pNON 3213, денонирована под номером

АТСС 53023. Замену кодирующей сГР (Л) последовательности кодирующей сГР (А) последовательностью в векторе экспрессии РВСН -I цодФ ек тверждают пра помощи выделения ДНК . РМОИ 3213 и последующем сечении упомянутого вектора экспрессии эндонуклеазами EcoRI u Hind ХХХ и получают фрагмент в 590 пар оснований, а се- . чение с использованием Нае III показывает присутствие дополнительного.

Hae III фрагмента рестрикции, который образуется из-sa присутствия кодона аланина в кодирующий сГР (А) последовательности ДНК. Окончательное подтверждение нрнсутствия кодирующей сГР (А) последовательности ДНК в векторе экспрессии РИОНИ 3213 получают при помощи частичного анализа последовательности фрагмента ЕсоКХ/Hind III в 590 пар оснований.

Экспрессию коднрующей сГР (А) последовательности ДНК и продуцированне сГР (А) в культуре Е. coli W3110 .осуществляют прм помощи тех же приемав, которые быпи описаны ранее и использовались при получении бГР (А, Л) и бГР (А,В). Аналогичным образом получают высокие .концентрации протеинов в 22000 дальтон, что устанавливают при помощи анализа ДСН-ПАГЭ.

Клетки Е. соХ1 V 3110, несущие вектор эксперссии РИСИ 3213, хранят так же, к%к описано ранее и используют для получения в больших количествах сГР (А) (ферментацию осуществляют в 10-130.-литровых емкостях=.

Содержание протеина сГР (А) в реакто ре "Ферментации емкостью 100 л состав-, ляет приблизительно 1 г/л. бульона.

Пример 3. Соматотропные палипептиды, синтезированные в культуре Е. coli подвергают очистке as неочищенных солюбилизированных светопреломпяющих тел, содержащих один из бГР (A,Ë), бГР (А,В), mat -. бГР (В) °

met - бГР (Л) или сГР (А) при помощи иммуноадсорбентной хроматографии.

Все три вида соматотропина, очищенные при помощи имчуноадсорбентной хроматографии, имели чистоту, превышающую 95Х. Этот факт устанавливают при помощи анализа ДСН-ПАГЭ с использованием 1 мг очищенного протеина на

7,5-15Х-ном (в/о) градиентном геле.

Концентрации протеинов очищенных ви1646489 дов бГР определяют при помощи известного анализа с использованием высакоразрешающей жидкостной хроматографии„

Протеины, очищенные при помощи хроматографии, основанной на принципе иммунного средства, для использования в анализе íà N-концевую последовательность, подвергают диализу до

Полного удаления воды, а затем лиофилизируют. Перед выполнением анализа

Й-концевой последовательности очищенные протеины снова суспендируют в буфер бикарбоната аммония, содержащий 50 мМ бикарбоната аммония плюс

О, 17 (в/о) ДСН, и подвергают диализу против того же буфера с тем, чтобы удалить остаточные трис/оксиметил/

/аминометан/трис/ и глицин,, В табл. 2 приведены результаты анализа N-концевой последовательностей для нескольких препаратов пали-. пептидов бГР (А,Л), бГР (A,В), met— бГР (Б), met - бГР (Л) и сГР (А) . 25

Количество протеина с N-концевым метионином приведено в процентах от общего содержания соматотропина в пробе, Для определения количества метионина используют два метода. При помощи непрямого метода количество

ИН -met-ala-рЪе... в преобладающей популяции NH -а1а-phe... вычисляют исходя из различий в lag-сигналах.

Так как зта процедура зависит ат некоторой оценки нормального запаздывания для последовательности, которое изменяется от цикла к циклу, она является лишь весьма грубой оценкой для содержащейся последовательности NH<-ala-phe... Прямой метод, содержащий реакцию молекулярной деградации Эдмана, заключается в сравнении мощности сигналов от PTH met относительно РТН-а1а после отделе45 ния РТН met от химического шума с ,:использованием высокоразрешающей жидкостной хроматографии (ВРЖХ). Б частности, реакция деградации Эдмана заключается во взаимодействии Nконцевой аминокислоты с реагентом, который отсекает эту аминокислоту, и в ее последующем высвобождении в форме РТН-производного этой аминокислоты, Последняя процедура будет да5с вать хорошие оценки (%) для met-alaphe ° .. в том случае, если загрязнение свободной аминокислотой является низким, Степень обработки N-концевого метионина варьирует в клетках от ферментации к ферментации, но всегда происходит в не менее 80% от всех молекул соматотропина, Пример 4. В табл. 3 показано изменение надоев молока, вызванное инъекцией солюбилизаванных видов бГР коровам. Из полученных данных видно, что бГР (А,В) и met-бГР стимулируют надои молока в гораздо более значительной степени, чем соответствующие им (содержащие лейцин) аналоги бГР (А,Л) и met-бГР (Л) . Кроме того, испытываемые валиновые бГРвиды при совместном сопоставлении с лейциновым бГР-видами дают B статистическом смысле (р=0,02) более значительный прирост. надоев молока.

Исследование проводят следующим образом.

Коровам породы Холстейн в период их второго и третьего триместра лактации дают 5 мл раствора бикарбоната натрия (рН 9,8+0,5), только (контроль) или содержащего примерно

25 мг бГР (А,В), бГР (А,Л), metбГР (В) или met - 6ГР (Л) (в дальнейшем все эти смеси вместе именуются испытуемыми соматотропннами), ежедневно. Все испытуемые соматотропины и контрольные пробы применяют парентерально при помощи внутрнмьппечной инъекции в полусухожильную мышцу еже.дневно в течение 21 дня. Фиксируют . ежедневный удой каждой коровы, начи- ная эа шесть дней до первой ежедневной инъекции и на протяжении 21 дня, в течение которых делали инъекции.

Анализируют каждую жирность, содержание протеинов в молоке и соматические клетки. Результаты, представленные в табл. 3, указывают, что увеличение надоев молока, полученное при применении бГР (A,Á) к коровам, примерно íà 50% вьппе, чем полученное при использовании бГР (А,Л) и примерно на 17% выше при применении met— бГР (В),чем при применении met— бГР (Л) .

Формула изобретения

Способ получения бычьего гормона роста, включающий получение кДНК, кодирующей бычий гормон роста, встраивание кДНК в бактериофаг, трансформацию полученными рекомбинантными фагами штаммов Escherichia coli, от1646489 отношении стимуляции лактации у коров, Ъ фрагмент кДНК, выделенный из плазмиды рГНе -I, с помощью сайт5 специфического мутагенеза встраивают

;кодон для апанина вслед за АТС кодоном и полученный модифицированный фрагмент реклонируют в плазмиду

pSCHe -I вместо последовательности

ДНК, кодирующей ВОН (Ь) .

2. Способ по п. 1, о т л и ч аю шийся тем, что бычий гормон представляет собой BGH (А,V) .

Таблица 1

Обозначение Затравочная последовательность протеина

Матрица

Обозначение плазииды

met — bGH{V) 5 ССТСССАТСТТССАССТСССССАТСАС

bGH(А, L) 5 САСАТАССТСССААССССАТАСААТТСТАС

ЬСН(А, V) 5 GGTGCCATCTTCCACCTCCCGCATCAG

pGH(A) 5 ССАСТГААТТСТАТГСССТТСССАССТАТС

Таблица 2

N-концевой метионин

- Ж

Проба

Непрямой Прямой

92., 0

20 ° 3

10,8

7,5 +"

16,7

16,7

Не выполнялся

100,0

18,4 с6 0 (3,0

9,0

17,0

100,0

met-бГР (Л) бГР (А,Л) 6ГР (А, В) сГР (А)

met-бГР (В) к Количество протеина с N-концевым метионином проведено в пересчете на проценты от общего содержания соматотропина в пробе, + Данные для протеина, очищенного после проведения двух отдельных ферментаций. бор клонов, содержащих рекомбинант. ные плазииды с геном бычьего гормона, выделение рекомбинантных плазмид и встраивание. кДНК из этих плаэмид в вектор экспрессии с последующей трансформацией полученной плазмидой экспрессии штаммов E. coli, отбором ,трансформированных штаммов, культивированием в питательной среде, выделением и очисткой конечного продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения биологической активности бычьего гормона роста в

M13mp8/ÂGÍ -I pMON 3214

М13тпрЗ/BGH „--I pMON 3209

M13mp8/BGH<>-I (а1а) PHON 3215

М1 Эа р9/РСНе -? pMON 3213

16

1646489

Таблица 3

Вероятность значимости

Недели исследования

Изменения относительно контроля

Процент нзменеОбработка lисло коров в каж2 3 ния относительно контроля дом испытании

9

33 9

22,8

32,7

28,0

8,6

5,8

8,3

7,1 р=0,02 р=0,33 р=0,02

П р и м е ч а н и е. Значения припедсны в пересчсте по методу наименьших квадратов (в килограммах) на корову (в день) молока с нормализованной жилкостью в 3, 57 жира.

Составитель Н,.Куэенкова

Редактор М.Петрова Техред С.Мигунова Корректор И.Эрдейи

Заказ 1353 Тираж 382 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

1.13035» Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент",. г.ужгород, ул. Гагарина,101

Контр.

ЬОН (А, V)

bGH. (А,L)

met . — bGH (V)

met — bGH (L)

ЬОН (A,V), ЬОН (A,L)

met — ЬОН (V)

met — ЬОН (1.)

Ча1 1.еи

25»5 24»6 26 0 25»4

32»? 33; 1 36»7 34»0

29,9 30,2 33,5 3 1,2

3 1, 6 33, 8 35» 8 33,7

31,0 32,1 34,2 32 5