Способ получения пепсина рыб

 

Изобретение относится к биотехнологии , а именно к способу получения пепсина из внутренних органов рыб. Цель изобретения -повышение удельной активности целевого продукта и его выхода, а также упрощение способа. Способ заключается в том, что в качестве сырьевого источника пепсина используется вся масса внутренних органов, содержащихся в брюшной полости рыб (желудок, кишечник, печень, почки и т.д.), которые гомогенизируют в растворе рН 2-6, Гомогенат инкубируют в течение 3-20 ч при комнатной температуре и центрифугируют. Значение рН супернатанта доводят до 1,7-2.4 и инкубируют 15-30 мин при комнатной температуре. Значение рН доводят до 4,4 центрифугируют, диализуют и подвергают очистке методом ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-носителе. Удельная активность пепсина по отношению к гемоглобину равна 1400-2800 ед/мг белка, выход по активности равен 30-87%. Ё

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (Бцз С 12 N 9/50

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4709574/13 (22) 26.06.89 (46) 30.05.91. Бюл, N. 20 (71) Научно-исследовательская лаборатория биологически активных веществ гидробионтов (72) И.Ю.Сахаров и Н.В.Сухова (53) 663.18(088.8) (56) Sanchez-Chlang 1 ., Cisternas Е., Ропез О.

Partlae purification of pepsins from aduet and

juvenal salmon fish Orcorhynchus keta,—

Comporative Biochemistry and Physiology, 1987, v. 87 В, р. 793-797.

Gllberg А. Purification and characterization of pepsins arctic flsh Mallotus

villonis. (54) СПОСОБПОЛУЧЕНИЯ ПЕПСИНА РЫБ (57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения пепсина

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения препарата пепсина из внутренних органов рыб, который может найти применение в научноисследовательской деятельности, медицине, пищевой и кожевенной промышленности.

Цель изобретения — повышение удельной активности целевого продукта и его выхода, а также упрощение способа.

Способ заключается в том, что в качестве сырьевого источника пепсина используют всю массу внутрених органов, содержащихся в брюшной полости рыб(желудок, кишечник, печень, почки и т.д.), которые гомогенизируют в растворе рН 2-6.

Затем гомогенат инкубируют в течение 3 — 20 ч при комнатной температуре и центрифуги„„ЯЦ„„1652342 А1 из внутренних органов рыб. Цель изобретения -повышение удельной активности целевого продукта и его выхода. а также упрощение способа. Способ заключается в том, что в качестве сырьевого источника пепсина используется вся масса внутренних органов, содержащихся в брюшной полости рыб (желудок, кишечник, печень, почки и т.д.), которые гомогенизируют в растворе рН 2 — 6, Гомогенат инкубируют в течение 3-20 ч при комнатной температуре и центрифугируют. Значение рН супернатанта доводят до 1,7 — 2,4 и инкубируют 15-30 мин при комнатной температуре. Значение рН доводят до 4,4 центрифугируют, диализуют и подвергают очистке методом ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-носителе.

Удельная активность пепсина по отношению к гемоглобину равна 1400 — 2800 ед/мг белка, выход по активности равен 30 — 87;(,. руют в течение 30 мин при 19000 g, 4 С, Для активации пепсиногена рН гомогената доводят до 1,7-2,4 и инкубируют 15 — 300 мин при комнатной температуре. Для окончания реакции активации рН поднимают до 4,4 с помощью 4 М раствора ацетата натрия. Для отделения образовавшегося осадка раствор центрифугируют при 19000 g в течение 40 мин. Супернатант диализуют против 5 мМ ацетатного буфера, рН 5, а в последствии наносят на колонку с ДЭАЭ-носителем, уравновешенным тем же буфером. Ферментативную активность злюируют тем же буфером. Удельная активность пепсина по отношению к гемоглобину равна 1400-2800 ед/мг белка. Выход по активности равен

30-870/,.

1652342

При проведении гомогенизации при рН выше 6 наблюдают понижение удельной активности целевого продукта. Аналогичный эффект наблюдают в растворах с рН ниже 2.

Экстракция пепсина в течение менее 3 ч приводит к понижению выхода. В интервале 3-20 ч величина выхода не изменяется, 20-часовую экстракцию проводят в течение, ночи, что позволяет более рационально п роводить процесс. Дальнейшее увеличение времени экстракции нецелесообразно.

Инкубация ферментного раствора при рН выше 2,4 и ниже 1,7 приводит к понижению удельной активности целевого продукта и его выхода.

Время инкубации пепсина при кислых рН выбрано на основании того факта, что при инкубации меньше 15 мин удельная активность пепсина невысока. Вместе с тем инкубация в течение более 300 мин (по-видимому, за счет инактивации) понижает величину активности целевого продукта.

Пример 1. 175 г внутренних органов мойвы гомогенизируют в 500 мл 5 мМ ацетатного буфера, рН 5. Гомогенат инкубируют в течение 20 ч при комнатной температуре, а затем центрифугируют в те, чение 30 мин при 19000 g, 4 С, Для активации пепсиногена рН гомогената доводят до

2 с помощью 2 н. HCI и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Для окончания реакции активации рН поднимают до 4,4 с помощью 4 М раствора ацетата натрия, Для отделения образовавшегося осадка раствор центрифугируют при 19000 g в течение 40 мин. Супернатант диализуют против 5 мМ ацетатного буфера, рН 5, а впоследствии наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной тем же буфером. Ферментативную активность элюируют тем же буфером. Удельная активность пепсина по отношению к гемоглобину равна 1400 ед/мг белка. Выход по активности равен 647ь.

Пример 2. 175 r внутренних органов анчоуса гомогенизируют в 500 мл 10 MM

HCI, рН 2. Гомогенат инкубируют в течение

30 мин при 19000 g, 4 С. Для окончания реации активации рН поднимают до 4,4 с помощью 4 М раствора ацетата натрия. Для отделения образовавшегося осадка раствора центрифугируют при 19000g в течение 40 мин. Супернатант диализуют против 5 мМ ацетатного буфера, рН 5, а впоследствии наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной тем же буфером. Ферментативную активность элюируют тем же буфером. Удельная активность пепсина по отношению к гемоглобину равна 1400 ед/мг белка. Выход по активности равен 87 .

Пример 3; 175 r внутренних органов анчоуса гомогенизируют в 500 мл 5 MM ацетатного буфера, рН 6. Гомогенат инкубируют в течение 4 ч при комнатной

5 температуре, а затем центрифугируют в течение 30 мин при 19000 g, 4 С. Для активации пепсиногена рН гомогената доводят до

1 7 с помощью 2 н. HCI и инкубируют 15 мин при комнатной температуре. Для окончания

10 реакции активации рН поднимают до 4.4 с помощью 4 М раствора ацетата натрия. Для отделения образовавшегося осадка раствор центрифугируют при 19000 g в течение 40 мин. Супернатант диализуют против 5 мМ

15 ацетатного буфера, рН 5, а впоследствии наносят на колонку с ДЭАЭ-сферонитом, уравновешенным тем же буфером. Фермен. тативную активность элюируют тем же буфером. Удельная активность пепсина по

20 отношению к гемоглобину равна 1500 ед/мг белка, Выход по активности равен 377,.

Пример 4. 175 г внутренних органов сельди гомогенизируют в 500 мл 5 мМ ацетатного буфера, рН 4. Гомогенат инкубиру25 ют в течение 3 ч при комнатной температуре, а затем центрифугируют в течение 30 мин при 19000 g, 4 С, Для активации пепсиногена рН гомогената доводят до

2,4 с помощью 2 н. HCI и ин кубируют 300 мин

30 при комнатной температуре. Для окончания реакции активации рН поднимают до 4,4 с помощью 4 М раствора ацетата натрия. Для отделения образовавшегося осадка раствора центрифугируют при 19000 g в течение 40

35 мин. Супернатант диализуют против 5 мМ ацетатного буфера. рН 5, а впоследствии наносят на колонку с ДЭАЭ-сфероном, уравновешенным тем же буфером. Ферментативную активность элюируют тем же

40 буфером. Удельная активность пепсина по отношению к гемоглобину равна 2800 ед/мг белка. Выход по активности равен ЗО .

Формула изобретения

Способ получения пепсина рыб, включающий гомогенизацию исходного сырья, активацию и очистку, отличающийся тем, что, с целью повышения удельной активности целевого продукта и его выхода, а

50 также упрощения способа, в качестве исходного сырья используют все внутренние органы из брюшной полости рыб, гомогенизацию ведут в растворе с рН 2-6 в течение 3-20 ч, активацию проводят при рН

55 1,7-2,4 в течение 15-300 мин, а очистку осуществляют методом ионообменной хроматографии на анионообмен нике, содержащем диэтиламиноэтил ьн ые групп ы,