Штамм бактерий рsеudомоnаs sp., разлагающий метилацетат

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма бактерий, который может быть использован при биологической очистке сточных вод ацетальдегидного производства. Целью изобретения является получение нового штамма микроорганизма, обладающего способностью разлагать метилацетат. Штамм PSEUDOMONAS SP. ВКМ В-1735Д выделен из сточных вод ацетальдегидного производства в Казахской ССР. Штамм обладает способностью полностью разлагать метилацетат при его концентрации до 1 г/л, используя продукты его гидролиза - метанол и ацетат в качестве источников углерода и энергии. После предварительной адаптации культуры она полностью разлагает метилацетат за 30 ч. 1 табл.

СО!ОЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

09) (10

s С 12 N 1/20, С 12 S 3/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4759036/13 (22) 28.08.89 (46) 07.08.91. Бюл, N. 29 (71) Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР и Институт микробйологии и вирусологии AH КазССР (72) Д.Ю.Раков, Н;В.Доронина, Ю.А.Троценко и Р,М.Алиева (53) 663.15(088.8) (56) Бюлер Н., Пирсон Д. Органические синтезы, ч. 2. — M.: Мир, 1973.

Вейганд-Хильгетач. Методы эксперимента в органической химии. — М.; Химия, .

1968. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOM0NAS

SP., РАЗЛАГАЮЩИЙ МЕТИЛАЦЕТАТ

Изобретение относится к области биотехнологии и. касается нового штамма бактерий, который может быть -использован при биологической очистке сточных вод ацетальдегидного производства.

Цель изобретения — получение нового штамма микроорганизма, обладающего способностью разлагать метилацетат.

Метилацетат (метиловый эфир уксусной кислоты) — летучий, в ысокотоксичн ый си нтетический поллютант, химически устойчивый при нормальных условиях. В литературе нет сведений о микробной деградации этого соединения.

Изобретение заключается атом; что выделен штамм Pseudomonas sp. 24 RA, разлагающий метилацетат. Предельная концентрация метилацетата, при которой наблюдается его полное разложение предлагаемым штаммом, 1 г/л. Штамм выделен (57) Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма бактерий, который может быть использован при биологической очистке сточных вод ацетальдегидного производства. Целью изобретения является получение нового штамма микроор.ганизма, обладающего способностью разлагать метилацетат. Штамм Pseudomonas sp, ВКМ В-1735Д выделен иэ сточных вод аце тальдегидного производства в Казахской

ССР. Штамм обладает способностью полностью разлагать метилацетат при его концентрации до 1 г/л, используя продукты его гидролиза — метанол и ацетат в качестве источников углерода и энергии. После предварительной адаптации культуры она полностью разлагает метилацетат за 30 ч.

1 табл. иэ сточных вод ацетальдегидного производства.

Штамм обладает карбоксилзстеразой и разлагает метилацетат, используя продукты

его гидролиза — ацетат и при низких концентрациях (до 0,1 г/л) метанол в качестве источников углерода и энергии.

Культурально-морфологические признаки. Клетки — бесцветные, подвижные палочки 0,5 — 0,7 1,3 — 1,7 мкм с одним полярным жгутиком, грамотрицательные, неспорообразующие, не имеющие сложных внутрицитоплазматических мембран, подобных метанотрофным бактериям. Не имеет простек. Размножается делением пополам.

Колонии на МПА до 5 мм в диаметре, округлые, непрозрачные, с ровным краем, белые, поверхность гладкая, профиль выпуклый, структура однородная, консистенция тесто-— образная.

1668391

Среды для выращивания: мясопептонный бульон (агар), синтетическая среда О (пример 1) с метилацетатом, глюкозо-картофельный агар.

Физиолого-биохимические признаки.

Азроб, растет при 10-39 С, оптимум 2832 С. Оптимум рН 6,8-7,2, при рН 3,6 не растет. Флоуресцирующие пигменты, пиоционин, каротиноиды не образует. Имеет оксидазу, каталазу, аргининдигидролазу.

Нитраты восстанавливает в нитриты. Леван из сахарозы, ацетоин, индол, ацетилме, тилкарбонол не образует. Желатин, целлюлозу, поли-Р-оксибутират не разлагает, но гидролизует крахмал и твин-80. Поли Р -оксибутират внутриклеточно не накапливается. DL- P -оксибутират не использует в качестве источника углерода в недостаточной по азоту среде. . Источниками углерода для роста слу1 жат; формиат, метанол или этанол при низких концентрациях(до 0,1 г/л), метилацетат, этилацетат, этилформиат, бутилацетат, изопропанол, изобутанол, 1=арабиноза, фруктоза. L"ðàìíîçà, D-рибоза, D-ксилоэа. глюкоза, сахароза, D-серин, ацетат, бетаин, саркозин, глицин, фумарат. сукцинат, и -кето глута рат.

Среду с глюкозой подкисляют, газообразование отсутствует. Анаэробно не ферментирует глюкозу. Рост не обеспечивают формальдегид, метиламин, деметиламин, триметиламин, этиламин, трегалоза, Р аланин, L-серин, фенилаланин, DL-аргинин. глиоксилат, и-оксибензоат. м-оксибензоат, мезоинозит.

Не растет автотрофно в атмосфере

СОг+ Н2+ 02. В качестве источников азота использует соли аммония, нитраты, некоторые аминокислоты. В ростовых факторах не нуждается.

Штамм обладает индуцибельной карбоксилэстеразой, катилизирующей гидролиз эфирной связи метилацетата с образованием метанола и ацетата, Ацетат ассимилируется через цикл трикарбоновых кислот и глиоксилатный шунт(изоцитратлиазу и малатсинтаэу). Метанол ассимилируется через сериновый путь С>-метаболизма, Штамм не имеет метанолдегидрогенаэы (ФМС, HAD), но обладает алкогольоксидазой, дегидрогеназами формальдегида (НАЦ, 63Н) и формиата (ФМС), оксипируватредуктазой, серинглиоксилатаминотрансферазой, малатлиазой, фосфоенолпируваткарбоксилазой, Ключевые ферменты рибулозомонофосфатного пути фиксации формальдегида(гексулозофосфатсинтеза) vi цикла Кальвина автотрофной фиксации углекислоты (рибулозобисфосфаткарбоксилаза) отсутствуют.

Штамм является факультативным мети5 лотрофом.

Условия хранения штамма.

Шамм хранится в лиофильно высушенном состоянии, защитная среда — молоко, при этом свойства штамма устойчивы. В ла10 бораторных условиях культура поддерживается на косяках с МПА и пересевается через

2 нед.

Поскольку карбоксилэстераза, осуществляющая. гидролиз эфирной связи метила15 цетата, индуцибельна, существенные отличия наблюдаются при использовании этого субстрата адаптированной и не адаптированной культурой. Адаптированная культура Pseudomonas sp. BKM В-1735Д

20 осуществляет разложение метилацетата при его концентрациях 0,1 — 2,0 г/л за

9-30 ч соответственно (таблица).

В стоках ацетальдегидного производства содержится около 0,15-0,29 г/л метила25 цетата, однако при залповых выбросах концентрация этого соединения может до.стигать 1,0 г/л, Пример 1. Использование метилацетата неадаптированной культурой.

3(Культуру Pseudomonas sp. 24 RA выра щивают íà MAA в течение суток, Суспензию выросшей культуры (неадаптированной) высевают в колбы на 750 мл со 100 мл среды следующего состава, г/л дистилли35 рованной воды: (NH4)2H2PO4 1;0; К2НР04

1,0; NaCI 5,0; М9304 7Hz02,0; РеЯО4 7НгО

0,004, Среду стерилиэуют при 1 атм 30 мин, метилацетат вносят в колбу в концентрации

1 г/л и после засева закрывают резиновой

40 пробкой для предотвращения испарения метилацетата.

Культуру выращивают на качалке при

180 об,/мин при 29 С. Контроль за процессом деградации метилацетата и анализ

45 содержания метанола осуществляют с помощью газовой хроматографии на хроматографе. Колонка (70 см, 2 мм) заполнена

Порапаком О. Скорость Н2 30 мл/мин, воздуха 300 мл/мин, N2 30 мл/мин. Температу50 ра колонки 110 С.

Ацетат определяют на газовом хроматографе, Колонка (1,8 мф= 4 мм) заполнена

Порапаком Q. Скорость Н 35 мл/мин, воздуха 300 мл/мин, Nz 35 мл/мин. Температу55 ра колонки 160 С, Процесс разложения метилацетата неадаптированной культурой начинается только через 7 сут. Содержание метилацетата по данным газовой хроматографии через 5 сут составляет 97 (, от исходного, через 6 сут

1668391

Формула изобретения

Штамм бактерий Pseudomonas sp. ВКМ

В-1735Д, разлагающий метилацетат.

Составитель И. Болотина

Техред М.Моргентал . Корректор М. Максимишинец

Редактор Н. Яцола

Заказ 2626 Тираж 362 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

92, через 7 сут 61, через 8 сут 10 и через 9 сут к началу стационарной фазы роста O . В среде накапливается 0,1 г/л метанола. Ацетат не обнаруживается, Пример 2. Использование метилаце- 5 тата адаптированной культурой.

30 мл суспензии, выросшей на среде с метилацетатом двухсуточной культуры

Pseudomonas sp. 24 RA ВКМ В-1735 Д(адаптированной не менее 3 пассажей на среде с 10 метилацетатом), высевают в колбы на

750 мл со 100 мл среды, описанной в примере 1. В качестве источника углерода и энергии вносят 1 г/л метилацетата.

Количественный газохроматографический 15 анализ культуральной жидкости на содержание метилацетата, метанола и ацетата проводят через каждые 3 ч в течение 30 ч культивирования. К 15 ч культивирования

20 деградируется 25 метилацетата, к 30 ч культура достигает стационарной фазы роста и метилацетат в среде не обнаруживается. В среде накапливается 0,1 г/л метанола, ацетат отсутствует.

Таким образом, штамм Psevdomonas

sp. ВКМ В-1735 Д обладает способностью полностью разлагать метилацетат при его концентрации до 1 г/л, используя продукции его гидролиза, ацетат и метанол в качестве источников углерода и энергии, что обеспечивает возможность использования данного штамма при биологической очистке промышленных сточных вод ацетальдегидного производства.