Рекомбинантная плазмидная днк 36к-pvh, кодирующая синтез иммуногенного белка 36к вируса осповакцины штамма ливп, и штамм бактерий еsснеriснiа coli - продуцент этого белка

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии и медицине. Целью изобретения является создание штамма E.COLI - продуцента иммуногенного белка 36 К вируса осповакцины штамма ЛИВП. Сконструирована векторная плазмида 36 К - PVH, содержащая FLA - ген, обеспечивающий устойчивость к ампициллину, и ген LAC Z с собственным промотором. При трансформации клеток E. COLI ВМН 71 - 18 плазмидой 36 К - PVH получают штамм - продуцент химерного белка, который обладает вирусной антигенной специфичностью, связывается с антителами сыворотки крови от переболевших животных и может быть использован для диагностических целей. Химерный белок является иммуногенным. Штамм бактерий, содержащий плазмиду 36 К - PVH, задепонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под номером В - 4743. 2 с.п.ф-лы, 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)з С 12 N 15 38, 1/20

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4719264/13 (22) 14.07.89 (46) 07;07.91. Бюл. ¹ 25 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологии Научнопроизводственного объединения "Вектор" (72) О.И.Рязанкина, А.И.Муравлев, Н,В.Чешенко, Н.А.Чикаев, С.Н.Щелкунов и Э.Г.Малыгин (53) 575.224.2:577.2/048(088.8) (56) J.VIrol, 1985, ч.56; № 2, р.534-540.

J.Virol, 1987, v.61, № 11, о.3550-3554. (54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДН К

36К-рчН, КОДИРУЮЩАЯ СИНТЕЗ ИММУНОГЕННОГО БЕЛКА 36К ВИРУСА ОСПОВАКЦИНЫ ШТАММА ЛИВП, И ШТАММ

БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI — ПРОДУЦЕНТ ЭТОГО БЕЛКА (57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, в частности может быть использовано для получения антисыворотки к иммуногенному белку, а также для тестирования антител, появляющихся при иммунизации вирусом осповакцины.

Целью изобретения является создание штамма Е.соИ вЂ” продуцента иммунногенного белка 36К вируса осповакцины штамма

ЛИВП, Сконструирована рекомбинатная плазмида 36К-pvH, зкспрессирующая химерный белок; состоящий из Р-гэлактозидазы и вирусного белка на ее С-конце. Плазмида 36КpvH, кодирующая белок 36К вируса осповакцины состоит из следующих элементов:

„„59 „„1661215 А1 и медицине. Целью изобретения является создание штамма Е.соИ вЂ” продуцента иммуногенного белка 36К вируса осповакцины штамма ЛИВП. Сконструирована векторная плазмида 36К-pvH, содержащая Ла-ген, обеспечивающий устойчивость к эмпициллину, и ген Iac Z с собственным промотором.

При трансформации клеток Е.coli BMH 7118 плазмидой 36К-pvH получают штамм— продуцент химерного белка, который обладает вирусной антигенной специфичностью, связывается с антителами сыворотки крови от переболевших животных и может быть использован для диагностических целей. Химерный белок является иммуногенным. Штамм бактерий, содержащий плазмиду 36К-рчН, задепонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под номером В-4743. 2 с.п. ф-лы, 1 табл. о» плазмидная ДНК вектора pUR 290, со- «р», держащего ген lac Z с собственным промотором, размер которой 5725 п.н. (мол.м, 3,8

МД);

Hind III — BspR — фрагмент плазмиды

DvH 64 с геном белка 36К вируса осповакци- «Л ны штамма ЛИВП, размер которого 1029 р.н. (мол. м. 0.69 Мд); ) м генетические маркеры — ген устойчиво- д сти к амициллину, ген lac Z и ген белка 36К

ВОВ, Размер плазмиды 36К-рчН равен 6754 п,н. (мол. м.4,5 МД).

Получен штамм Escherichia coli ВКПМ В

4743 — продуцент иммуногенного белка 36К вируса осповакцины штамма ЛИПВ.

Полученный штамм характеризуется следующими признаками, 1661215

Морфологические признаки.

Клетки и рямые, палочковидной формы с размерами 1,2 — 1,6х2 — 6 мкм, подвижные с перитрихиальными жгутиками, грамотрицател ьные, неспороносные.

Культурэльные признаки.

Клетки хорошо растут на простых питательных средах, оптимальная температура роста 30 — 37 С, рН 6,8 — 7,5, При росте на мясопетонном и рыбном агэре развиваются в виде гладких, круглых, блестящих, серых, мутных колоний с ровными краями, При ро, сте в жидких средах вызывают равномерное помутнение с образованием осадка.

Физиолого-биохимические признаки.

Клетки растут в интервале температуре

4-45 С, желатин не разжижают, восстанавливают нитраты и нитриты. В качестве источника углерода используют многие углеводы и аминокислоты, В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной и нитратной формах; так v, органические соединения в виде пептона и э ми н о к и сл от.

Устойчивость к антибиотикам.

Штамм проявляет устойчивость к ампициллину, обусловленную наличием рекомбинантной плазмиды.

Стабильность плазмиды в штамме.

При поддержании штамма в течение 2 лет на рыбном агаре при 4 С или в ЗОО/-ном глицерине при -70 С в присутствии ампициллина не наблюдается перестройки или утери плэзмиды.

Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов института "ВНИИгенетика" под номером ВКПМ В-4743.

Пример 1, Получение штамма бактерий — продуцента белка 36К вируса осповакцины.

Клетки бактерий Е.coli BMH 71-18, содержащие плазмидную ДНК pvH 290, и клетки бактерий Е,coll Н В 101, содержащие плазмидную ДНК рчН 64, выращивают в 0,5 л бульона с ампициллином в концентрации

40 мкг!мл до титра 5х10 кл/мл и проводят амплификацию плазмиды в течение ночи.

Клетки осаждают центрифугированием (5000g, 5 мин, 4 С) и выделяют из них плазмидную ДНК.

Полученные препараты ДНК плазмид

pUR 290 и pvH 64 используют для конструирования плазмиды 36К вЂ” рчН, которое проводят следующим образом.

Осуществляют неполный гидролиз 120 мкг ДНК pUR 290 эндонуклеазой рестрикции Cia 1 в буфере А (50 мМ трис HCI, рН 7,6;

50 мМ NaCI; 10 мМ Mg Clz: 1 мМ 2-меркаптоэтанол) и электроэлюируют линейную форму плазмиды на диализную мембрану, Выход линейной формы ДНК составляет

10 от суммарного количества гидролизован ной ДН К. В ыступающие "липкие" кон5 цы достраивают до "тупых" фрагментом

Кленова ДНК-полимеразы. Затем ДНК гидролизуют эндонуклеазой рестрикции Hind

III в буфере А и электроэлюируют на диализную мембрану фрагмент 5720 п.н.

10 Для выделения индивидуального гена белка 36К 20 мкг ДНК плазмиды pvH 64, содержащей Hind I I I-P, фрагмент вируса осповакцины инкубируют с эндонуклеазами рестрикции Hind III u Bsp Rl в буфере А и

15 электроэлюируют на диализную мембрану фрагмент 1029 п.н, Полученные препараты ДНК вектора и фрагмента смешивают в соотношении 1:10 в буфере В (66 мМ трис HCI, рН 7,5; 6,5 мМ

20 MgCIz, 10 мМ дитиотрейтол; 0,4 мМ АТФ) с помощью ДНК-лигазы фага Т4(72 ед/мкл) иэ расчета 1 мкл фермента на 50 мкг ДНК.

Инкубируют 16 — 20 ч при 4 С. Полученную смесь плазмид используют для трансформа25 ции клеток Е.соИ BMH 71-18. Трансформированные клетки высевают на агаризованную среду LB с ампициллином (40 мкг/мл) и растят 24 ч при 37 С.

Клоны, содержащие рекомбинатную

30 плазмидную ДНК с геном белка 36К, отбирают с помощью гибридизации in situ c Pзондом, приготовленным на основе

Hind lII — Bsp Rl фрагмента 1020 п.н. Иэ клеток клонов, дающих положительный от35 вет в гибридизации с Р-зондом, выделяют

32 плазмидную ДНК, обозначенную 36К-рчН, содержащую в своем составе фрагмент вирусной ДНК 1029 п.н. с геном белка 36К.

Анализ совпадения рамок трансляции

40 гена lac 2 и гена белка 36К в клонах, содержащих рекомбинатную плазмидную ДНК, осуществляют с помощью доказательства синтеза этими клонами химерного белка с мол, м. 145 — 150 КД, Для этого клетки из

45 отдельных клонов, дающих положительный ответ в реакции гибридизации с P-зондом, 32 высевают в 5 мл LB, содержащего 40 мкг/мл ампициллина, и растят в течение 16 ч. Затем

0,35 мл ночной культуры вносят в 0,5 мл

50 свежего LB, содержащего 40 мкг/мл ампициллина, растят до плотности суспензии

0,6-0,7 ОЕ/мл при 600 нм и добавляют изопропил-Р-Д-тиогалактопиранозид(ИПТГ) до концентрации 0,001М для индукции синтеза

55 Р-галактозидазы. Клетки растят еще 4 ч до плотности 1,7 ОЕ/мл при 600 нм, осаждают центрифугированием (5000g, 5 мин, 4 С ). осадок ресуспендируют в 5 мл физиологического раствора (0,15 M NeCI) и снова осаж1661215

10

20

30

40

5S дают центрифугированием. Для получения лизата клеток осадок ресуспендируют в 0,4 мл 10 мМ трис HCl, рН 8, добавляют 1 мг лизоцима в 0,1 мл 10 мМ трис HCI, рН 8 и выдерживают 20 мин, Затем озвучивают 5 раз по 20 с во льду.

Анализ синтезируемых клетками белков осуществляют с помощью электрофореза в прерывистой буферной системе в 8% ДДС—

ПААГ 10 кмл лизата клеток. После окраски белков 0,25% Кумасси в 50%-ном спирте с

7% уксусной кислоты гель отмывают 2 — 16 ч в 20%-ном спирте с 7% уксусной кислоты.

Результаты проведенного анализа показывают, что отобранные клоны при выращивании на среде с ИПТГ синтезируют белок с мол. м." 145 — 150 КД. Следовательно, встройку гена белка 35К в векторную плазмиду pUR 290 осуществляют так, что рамки трансляции генов lac Z и белка 36К совпадают, так как согласно первичной структуре

Hind ill — P фрагмента при несовпадении рамок трансляции происходит терминация синтеза белка в начале встроенного фрагмента, Таким образом, получают бактериальный продуцент белка 36К вируса осповакцины, обозначенный Е.coll

В MH /36 К-pv Н.

Анализ генетических маркеров в плазмиде проводят следующим образом.

Резистентнось к ампициллину клеток штамма Е.соИ ВМН/36К-рчН, содержащих плазмиду 36К-pvH, анализируют на агаризованной среде с содержанием ампициллина 10 — 100 мкг/мл. Данные клетки растут на средах с этой концентрацией ампициллина.

Наличие в клетках, содержащих плазмиду 36К-рчН, химерного белка устанавливают по окрашиванию колоний Е.coli, содержащих эту плазмиду, в синий цвет на .агаризованной среде с 0,05 мг/мл 5-бромо4-хлоро-3-индоксил Р -Д-галактопиранозида (Xgal) и 10 М ИПТГ.

Наличие в клетках Е.соП, содержащих плазмиду 36К-рчН, белка 36К вируса осповакцины, который входит в состав химерного белка, устанавливают по связыванию вирусоспецифической лапинной антисыворотки (ЛА), полученной в результате развития у кролика инфекционного процесса; а также антисыворотки, полученной к мембранам клеток CV-1, инфицированных вирусом осповакцины (анти M), с лизатами клеток Е.соИ из отдельных клонов в реакции радиоиммуноанализа.

В качестве контроля используют сыворотку неимунного животного (НКС). В качестве отрицательного контроля антигена используют лизат Е coll, содержащий вместо химерного белка)3- галактозидазуф — гал). в качестве положительного контроля — тот же лизат с добавлением NP-40 фракции вируса осповакцины (P-ran + NP).

Результаты представлены в виде счетов радиоактивности (имп/мин). Приведены средние значения результатов двух повторов. Разведения антисывороток 1:50.

Результаты анализа. представленные в таблице, свидетельствуют о том, что экспрессирующийся химерный белок обладает вирусной антигенной специфичностью, Лапинная антисыворотка, полученная в результате развития у кролика инфекционного процесса, содержит антител-, связывающиеся с химерным белком. Исследуемый белок, по-видимому, входит в состав мембран инфицированных клеток, так как связывается с антителами, содержащимися в сыворотке к мембранам клеток, инфицированных вирусом.

Пример 2. Иммуногенные свойства белка 36К в составе химерного белка.

Получают моноспецифические антисыворотки к химерному белку (мол. мас.

145 — 150 КД), который появляется в лизате клеток Е.соИ, трансформированных рекомбинатной плазмидой 36К-pvH, а также к Ргалактозидазе, полученной из лизатов клеток Е,coli, трансформированных исходной плазмидой pUR 290.

Полученные антисыворотки реагируют в РИА с бактериальными лизатами, содержащими химерный белок, показывая титры i: 100. Антисыворотка, полученная к химерному белку в РИА не реагирует с оболочкой и сердцевиной вируса, но реагирует с лизатами и мембранами инфицированных клеток.

Для идентификации продукта гена 36К проводят радиоиммуноблотинг различных фракций вируса осповакцины, лизатов и мембран инфицированных и неинфицированных клеток CV-1 с антисывороткой к химерному белку.

По радиоавтографу определяют, что данная антисыворотка связывается с белком с мол. м. 36 КД, содержащимся в лизатах и мембранах инфицированных клеток, и не связывается с различными фракциями вируса. Наблюдается незначительное неспецифическое связывание с сердцевинными белками вируса в области 62 и 58 КД. Это свидетельствует о том, что химерный блок является иммуногенным и обладает вирусной специфичностью.

Таким образом, изобретение позволяет получить иммуногенный вирусный белок

36К, который может быть использован для

1661215 получения антисыворотки к этому белку, а также для тестирования антител, появляющихся при иммунизации вирусом осповакцины.

Составитель T. Забойкина

Редактор М. Стрельникова Техред М;Моргентал Корректор Н. Король

Заказ 2097 . Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина. 101

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДН К 36КрчН, кодирующая синтез иммуногенного белка 36К вируса осповакцины штамма

ЛИВП, размером 6754 п.н, и мол.м. 4,5 МД, содержащая С!а I — Hind III — фрагмент вектора pVR 290 размером 5725 п.н. и мол. м.

3,8 МД, Hind III — Bsp Rl — фрагмент ДНК вируса осповакцины с геном белка 36К размером 1029 п.н. и мол.м. 0,69 МД; сайты для эндонуклеаз рестрикции: по три участка расщепления рестриктазы EciR!, Cia I, два участка расщепления рестрикта5 ции Ваа Hl, по одному участку расщепления рестриктаэ Hind ill, Pst I, Sal I, генетические маркеры: — Ар"- ген устойчивости к ампициллину;

10 — lac Z — ген j3-галактозидазы.

2, Штамм бактерий Escherichia coll

ВКПМ В-4743 — продуцент иммуногенного белка 36К вируса осповакцины штамма

15 ЛИВП.