Питательная среда для культивирования светящихся бактерий рнотовастеriuм lеiоgnатнi - продуцента люцифреразы
Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в микробиологической промышленности для выращивания светящихся бактерий продуцентов фермента люциферазы. Цель изобретения - удешевление среды, увеличение выхода биомассы бактерий и удельной активности люциферазы. Активность увеличивается в 3 раза. Питательную среду для культивирования PHOTOBACTERIUM LEIOGPATHI - продуцента люциферазы готовят на основе 0,25 - 2,5 %-ного кислотно-ферментативного гидролизата из отходов переработки биомассы светящихся бактерий PHOTOBACTERIUM LEIOGNATHI после выделения фермента люциферазы. Для приготовления гидролизата остатки клеток светящихся бактерий после удаления из них люциферазы обрабатывают 0,5 н. раствором соляной кислоты, а затем проводят ферментативный гидролиз панкреатином. 3 ил.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
F(! ЕЕВИЧ
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ (а
О
К) (л3
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4664888/13 (22) 21.03.89 (46) 15.07,91. Бюл. № 26 (71) Институт биофизики АН СССР (72) И.Н.Трубачев, Э.К.Родичева и Ю.И.Баянова (53) 577,15 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР
¹ 1070913, кл. С 12 N 9/04, 1983.
Nealson К.Н., Hastings J.W. Zow Okygen
is optimal for Zuciferase synthesis in some
bacteria. Arch. Microbiol, 1977, ч, 112, р, 916.
Yitelson J.J„ВойсЬеча Е,K„Fisch А,M.
et al. Continious culture as the means of ! От!пезсем reaction Enzyme-Zuciferase
obtaining. Contin. Cultiv. Microorganism
Proc, 7 — th Symposium, Prague 1978, publiched: Prague 1980, р. 807-814. (54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ СВЕТЯЩИХСЯ БАКТЕРИЙ
Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в микробиологической промышленности для выращивания светящихся бактерий — продуцентов фермента люциферазы.
Цель изобретения — удешевление среды, увеличение выхода биомассы и удельной активности люциферазы.
На фиг. 1 показано изменение оптической плотности культуры светящихся бактерий Photobacterium leiognathi штамм 213 при различной концентрации гидролизата, „, Я2„„1663023 А1
P HOTO BACTERIUM LE l OG NATH l — П РОДУЦЕНТА ЛЮЦИФЕРАЗЫ (57) Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в микробиологической промышленности для выращивания светящихся бактерий проду.центов фермента люциферазы. Цель изобретения — удешевление среды, увеличение выхода биомассы бактерий и удельной активности люциферазы, Активность увеличивается в 3 раза. Питательную среду для культивирования Photobacter чгп ieiognathi — продуцента люциферазы готовят на основе 0,25 — 2,5%-ной кислотно-ферментативного гидролизата из отходов переработки биомассы светящихся бактерий Phofobacterium leiognathi после выделения фермента люциферазы. Для приготовления гидролизата остатки клеток светящихся бактерий после удаления из них люциферазы обрабатывают 0,5 н. раствором соляной кислоты, а затем проводят ферментативный гидролиз панкреатином. 3 ил. где К вЂ” контрольная питательная среда с 5 г/л пептона; 1 — 5 — питательная среда с заменой пептона гидролизатом в разной концентрации; 1 — 0 25%; 2 — 0,5%; 3 — 1%; 4 — 2,5%; 5-5%; на фиг. 2 — изменение удельной интенсивности люминесценции светящихся бактерий Photobacterium ieiognathi штамм 213 при различной концентрации гидролизата, где К вЂ” контрольная питательная среда с 5 г/л пептона; 1 — 5 — питательные среды с заменой пептона гидролизатом в разной концентрации; 1 — 0,25%; 2 — 0,5%: 1663023 1,10 0,41 0,90 1,60 0,78 0.57 2,20 0,50 0,80 1,03 0,12 1,01 0,47 0,86 1,20 0,58 0,71 3 — 1%; 4 — 2,5%, 5 — 5%; на фиг, 3 — изменение оптической плотности и удельной интенСивности люминесценции культуры светящихся бактерий Photobacterium leiognathi штамм 208 на контрольной среде (1, 2) и среде с содержанием гидролиэата 1% (1, 2). Изобретение осуществляют следующим образом. Готовят питательную среду, содержащую, г: глицерин — 2,8 — 3,2; КагН РО4 12Н О 5,0 — 7,0; КН РО4 0,9 — 1,1; (NH4)g НРО4 0,45— 0,55; MgSO4 7Н О 0,09 — 0,11. В качестве источника азота и стимулирующих веществ используют 0,25 — 2,5%-ный гидролизат из отходов переработки биомассы светящихся бактерий после выделения люциферазы, Гидролиэат добавляют в среду до 1 л, Для приготовления гидролизата готовят 5%-ную (по сухому весу) суспензию из остатков клеток светящихся бактерий после извлечения из них люциферазы в 0,5 н. растворе соляной кислоты и выдерживают ее 2/3 ч на кипящей водяной бане. После охлаждения суспензии доводят значение рН до 7,8 — 8,0 30%-ным раствором гидроокиси натрия и добавляют панкреатин в количестве 5% от сухого веса биомассы, Суспензию термостатируют в течение 2 сут. при 45 С в присутствии хлороформа (1%) при периодическом перемешивании . Непрогидролизованный остаток биомассы отделяют центрифугированием, гидролизат нейтрализуют, отстаивают и используют в качестве компонента питательной среды, Гидролизат, полученный таким образом, имеет следующий состав, г/л: Азот общий 4,2 Азот аминный 1,1 Углеводы общие 2,7 Нуклеиновые компоненты 5,6 Аминокислоты Лизин Гистидин Аргинин Аспаргиновая кислота Треонин Серин Глютаминовая кислота Пролин Глицин Аланин Цистин Валин Метионин Изолейцин Лейцин Тирозин Фенилаланин 50 рий Photobacterium leiognathi 213 и наблюдают рост и люминесценцию бактерий. Как видно из результатов, представленных на фиг. 1 и 2 (кривые 2), концентрация биомассы, выращенной на среде с гидролизатом, измеренная по оптической плотности, а также интенсивность люминесценции через 4 ч от начала культивирования выше контрольных на 25 и 12% соответственно, 10 Минеральные элементы Фосфор 0,69 Магний 0,04 Сера 0,08 Калий 0,05 Хлорид натрия 0,30 Получают гидролизат с концентрацией отходов из биомассы светящихся бактерий 5% по сухому весу. Для получения питательной среды с меньшими концентрациями гидролизата берут исходный 5%-ный гидролизат и разво-. дят в определенном соотношении со средой, содержащей все остальные компоненты, Получают питательные среды, содержащие гидролизат из отходов переработки светящихся бактерий с концентрацией 0,25; 0,5; 1,0; 2,5: 5,0%. Пример 1. В стерильную колбу объемом 500 мл заливают 142,5 мл стерильной питательной среды, содержащей, г/л; NaCI 30-0; КагНРО4 12Н20 6,0; КНгРОд 1,0; (NH4)2HPO40,5; MgSO4 7Н О 0,1; глицерин 3,0 и 7,5 мл, 5% гидролизата из светящихся бактерий. Таким образом получают питательную среду с содержанием гидролизата по сухому весу 0 25%, Затем вводят 1 M/l стерильного инокулята светящихся бактерий Photobacterium Ieiognathi 213, в процессе ин куба ции наблюдают рост и люминесценцию бактерий. Как видно из результатов, представленных на фиг, 1 и 2 (кривые 1), концентрация биомассы, выращенной на среде с гидролизатом, измеренная по оптической плотности, а также интенсивность люминесценции через 3 ч от начала культивирования ниже контрольной (среда с пептоном) на 6 и 4% соответственно. Пример 2. В стерильную колбу обьемом 500 мл заливают 135 мл стерильной питательной среды, содержащей, г/л: NaCI 28,0; NazHP04 12Н О; KHzPO4 0,9; (ИН4)гНРО40,45; MgS04 .7HzO 0,09; глицерин 2,8 и 15 мл 5% гидролизата иэ светящихся бактерий. Таким образом получают питательную среду с содержанием гидролизата по сухому весу,0,5%. Затем вводят 1 мл стерильного инокулята светящихся бакте1663023 20 30 45 55 Пример 3. В стерильную колбу объемом 500 мл заливают 120 мл стерильной питательной среды, содержащий, г/л; NaCI 32,0; Na2HP04 12Н20 7,0; КН2РО4 1,1; (МН4)2Н РО4 0,55; Mg S04 7Н20 0,1; глицерин 3,2 и 30 мл 5% гидролизата из светящихся бактерий. Таким образом получают питательную среду с содержанием гидролизата по сухому весу 1%. Затем вводят 1 мл инокулята светящихся бактерий Photobacterium leiognathl 213 и наблюдают рост и люминесценцию. Как видно из результатов, представленных на фиг. 1 и 2 (кривые 3), концентрация биомассы, выращенной на среде с гидролизатом, измеренная по оптической плотности, а также интенсивность люминесценции через 4 ч от начала культивирования выше контрольных на 120 и 48% соответственно. Пример 4. В стерильную колбу объемом 500 мл загружают 75 мл стерильной питательной среды, содержащей, г/л: NaС! 30,0; Na2HP04 12HzO 6,0; KHzPO4 1,0; (NH4)zHPO4 0,5; MgSO4 7Н20 0,1; глицерин 3,0 и 75 мл 5 гидролизата из светящихся бактерий. Таким образом получают питательную среду с содержанием гидролизата светящихся бактерий по сухому весу 2,5%. Затем вводят 1 мл инокулята светящихся бактерий Photobacterium leiognathi 213 и наблюдают рост и люминесценцию. Как видно из результатов, представленных на фиг. 1 и 2 (кривые 4), концентрация биомассы, выращенной на среде с гидролизотом, измеренная по оптической плотности, а также интенсивность люминесценции через 5 ч от начала культивирования выше контрольных на 40 и 20% соответственно. Пример 5. В стерильную колбу обьемом 500 мл заливают 150 мл стерильного 5 -ного гидролизата, содержащего, г/л: Иа НРО4 12НгО 6,0; КН РО4 1,0; (NH4)2HPO4 0,5; MgS04 7НгО 0,1; NaCI 30,0 глицерин 3,0. Затем вводят 1 мл инокулята светящихся бактерий Photobacterium lelognathi штамм 213 и наблюдают рост и люминесценцию. Как видно из результатов, представленных на фиг. 1 и 2 (кривые 5), концентрация биомассы, выращенной на оптической плотности, а также интенсивность люминесценции в течение всего времени культивирования остаются существенно ниже контрольных значений. Пример 6. В стерильную колбу объемом 500 мл заливают 120 мл стерильной питательной среды, содержащей, г/л: Na CI 30,0; NazHPO4 12Н О 6,0; KHzPO< 1,0; (ИН4)гНРО4 0,5; MgS04 . 7Н20 0,1; глицерин 3,0 и 30 мл гидролизата из светящихся бактерий, Таким образом получают питательную среду с содержанием гидролизата светящихся бактерий по сухому весу 1%. Затем вводят 1 мл инокулята светящихся бактерий Photobacterium leiognathi штамм 208 и наблюдают рост и люминесценцию. Как видно из результатов, представленных на фиг. 3, концентрация биомассы, выращенной на среде с гидрозатвором, измеренная по оптической плотности (кривые 1), а также интенсивность люминесценции (кривая 2) через 4 ч от начала культивирования были выше контрольных на 95 и 70% соответственно. Кэк видно из представленных данных, использование в качестве стимулятора роста бактерий гидролизата из отходов светящихся бактерий, получаемых после выделения люциферэзы, в концентрациях от 0,5 до 2,5% по сухому весу позволяет повышать выход фермента люциферазы за счет увеличения выхода биомассы и повышения максимальной удельной интенсивности люминесценции в 3 раза по сравнению с известной, Формула изобретения Питательная среда для hóëüòèâèðoâàния светящихся бактерий Photobacterium lelognathi — продуцента люциферазы, содержащая глицерин в качестве источника углерода, источника азота и стимулирующих веществ, хлористый натрий, двузамещенный фосфорнокислый натрий, однозамещенный фосфорнокислый калий, двузамещенный фосфорнокислый аммоний и сернокислый магний, отличающаяся тем, что, с целью удешевления среды, увеличения выхода биомассы бактерий и удельной активности люциферазы, среда содержит в качестве источника азота и стимулирующих веществ 0,25 — 2,5%-ный кислотно-ферментативный гидролизат из отходов переработки биомассы продуцента после выделения люциферазы при следующем соотношении компонентов, г/л: хлористый натрий 28,0 — 30,0; двузамещенный фосфорнокислый натрий 5,0 — 7,0; однозамещенный фосфорнокислый калий 0,9 — 1,1; двузамещенный фосфорнокислый аммоний 0,45-0.55; сернокислый магний 0,09 — 0,11; глицерин 2,8 — 3,2; 0,25 — 2,5%-ный кислотноферментативный гидролизат из отходов переработки биомассы продуцента после выделения люциферазы до 1 и. 1663023 1663023 l/Ю .Роте. олт. ео. 1 2 3 Составитель Е.Воробьева Редактор М.Недолуженко Техред М.Моргентал Корректор М.Шароши Заказ 2237 Тираж 375 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101
