Штамм дрожжей sасснаrомyсеs cerevisiae - продуцент интерлейкина-2 человека

 

Изобретение относится к биотехнологии , в частности к молекулярной генетике и генной инженерии. Целью изобретения является повышение уровня синтеза интер лейкина-2 человека в культуральную среду Штамм ВКПМ У1180 получают на основе штаммов АН22-214 и ЗГ-НЗ с последующей трансформацией сконструированной плазмидой pSJI 711, содержащей гибридный ген интерлейкина-2 человека под контролем промотора и препрообласти гена альфа фактора дрожжей. Штамм ВКПМ V1180 можно использовать для разработки иммунодиагностикумов по количественному тестированию интерлейкина-2 человека в биологических жидкостях, а также при разработке препарата для лечения ряда онкологических заболеваний. Уровень синтеза интерлейкина-2 в культуральную среду составляет 4 мкг/л. со С

СОГОЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (Я)5 С 12 N 15/26

ГОСУДАРСТВЕННЫИ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4712192/13 (22) 29,06.89 (46) 15.10.91, Бюл. М 38 (7.1) Всесоюзный кардиологический научный центр AMH СССР, Институт органического синтеза АН ЛатвССР, Всесоюзный гематологический научный центр и Белорусский научно-исследовательский институт переливания крови (72) В,Н.Ураков, В,В.Кушниров, И,Л.Коричнева, И.И.Агапов, А.Г,Тоневицкий, А.Ю,Циманис, Э.Я.Грен, К.Г.Скрябин, А.В.Панютич, Н. Н. В ойтенок, М.Д.Тер-Ава неся н и

В,Н.Ñìèðíîâ (53) 612.017.1:616-006-0,52(088.8) (56) РСТ М 85-02200, кл, С 12 Р 21/00, приор. 09.11,84, (54) ШТАММ ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES

CEREVISIAE — ПРОДУЦЕНТ ИНТЕРЛЕЙКИНА -2 ЧЕЛОВЕКА

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к молекулярной генетике и генной инженерии.

Целью изобретения является повышение уровня синтеза интерлейкина-2 человека в культуральную среду.

Пример 1 . Штамм Saccharomyces

cerevlslae AH22-214/pVT2, несущий плазмиду рУТ2 (которая содержит ген альфаамилазы В.amyloliguifaclense, придающий клетке способность гидролиэовать крахмал) и имеющий мутацию по образованию повы- . шенных зон гидролиза на чашках с крахмалом, скрещивают со штаммом S.cerevisiae

ЗГ-HÇ, полученным из спорового потомства

„„50ÄÄ 1684339 А1 (57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к молекулярной генетике и генной инженерии, Целью изобретения является повышение уровня синтеза интерлейкина-2 человека в культуральную среду.

Штамм ВКПМ У1180 получают на основе штаммов АН22-214 и ЗГ-НЗ с последующей трансформацией сконструированной плаэмидой pSJI 711, содержащей гибридный ген интерлейкина-2 человека под контролем промотора и препрообласти гена альфафактора дрожжей, Штамм ВКПМ У1180 можно использовать для разработки иммунодиагностикумов по количественному тестированию интерлейкина-2 человека в биологических жидкостях, а также при разработке препарата для лечения ряда онкологических заболеваний. Уровень синтеза интерлейкина-2 в культуральную среду составляет 4 мкг/л. гибридного диплоидного штамма

S.cerevlsiae 52В Х GRF18. В результате отбирают штамм 6В-Н28/рУТ2, в котором экспо ессию гена альфа-фактора можно ре улировать температурой, и который облад,ет cflocoGHocTblo к повышенной секреции альфа-амилазы, Штамм 6В-Н28 получен из штамма 6В-Н28/рУТ2 в результате замены плаэмиды EcoR I — Hind III / фрагмент (1,25 т.п,н.) плазмиды рУС19/àl, содержащий промотор и препрообласть гена альфафактора, кланируют в плаэмиде pBR322 по тем же сайтам с последующим переклонированием по сайтам EcoR I -- Bam IVII в плаэмиду pVC19, в которой отсутствует Hind III

1684339

-сайт. В результате - олучаю плаэмиду рВА14, которую затем обр-батывают рестриктаэой и полимераэой Кленова в присутствии дезоксирибонуклеотидтрифосфатов, а затем рестриктазой Sal l. В обработанную таким образом плаэмиду рВА14 кпонируют СЫ3/Klenow-Sal I фрагмент (0,55 т.н,э. плазмиды рАА1213,23, содержащий структурную область гена интерлейкина-2 человека, и в результате получают плазмиду pAI9, Есор-Sal I — фрагмент (1,8 т.п,н) плазмиды рА19 клонируют по тем же сайтам в плаэмиду pFTP4, содержащую терминатор транскрипции гена кислой фосфатазы РН05.

В полученной таким образом плаэмиде рУ116 сайт EcoR I затем заменяют при помощи линкеров на сайт Вагп М1, в результате получают плазмиду р Y116B.Ham MI — Hind ill — фрагмент плаэмиды рYII68 клонируют в плазмиду pJ08207 и получают плазмиду

pSJl711 размером 8,9 т.п,н„содержащую ген ИЛ-2 человека под контролем препрообласти гена альфа-фактора и способная к репликации в дрожжах.

Штамм бВ-Н28/рЯ,.11711 — продуцент интерлейкина-2 человека получен трансформацией клеток S.cerevlslae 6В-Н28 плазмидой pS J1711, Характеристики штамма ВКПМ У1180, Морфологические, Клетки округлые, имеют размер 10 — 30 м км.

Кул ьтурал ь н ые;

Клетки штамма хорошо растут в среде

YN 8 с гистидином (50 мг/л) и образуют ровную интенсивную суспензию, При росте на агаризаванных средах того же состава образуьот белые выпуклые колонии с ровными краями.

Физиолого-биохимические.

Клетки наращива.от при 330 С, индукция гибридного гена интерлейкина 2 происходит при понижении те пературы до 27 С.

Оптимум рН находится в интервале 4,0-5,0.

В качестве источника углерода используют глюкозу, а в качестве источника азота — минеральные соли в аммонийной и нитратной форме.

Штамм является ауксотрофом по гистидину.

Содержание интерлейкина-2 человека в культуральной среде данного штамма составляет 4 мг/л, Штапмм 6В-Н28/pSJ 1711 депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ

Y i 180, Пример 2. Определение количества интерлейкина-2 человека в культуральной среде штамма ВКПМ У1180.

Клетки штамма ВКПМ У1180 засевают в

10 мл среды YNB с гистидином (50 мкг/мл) и наращивают до плотности ОРе00 =- 5,0 при

33 С. Затем в среду дополнительно добавляют 0,5 мл 40;4 глюкозы и клетки инкубируют еще 24 ч при 27 С с интенсивной азрацией. Затем клетки осаждают (10 мин при 4000 об/мин) и ИЛ-2 в супернатанте тестируют радиоиммунологическим методом при помощи стандартного набора фирмы Amersham.

Количество ИЛ-2 в культуральной среде штамма ВКПМ У1180 достигает 4 мг/л.

Биологическую активность препаратов интерлейкина-2 текстируfoT по включению

/ЗН/-тимидина в CTLL-клетки. CTLL-клетки представляют собой линию ИЛ-2-зависимых лимфоидных клеток, для поддержания которых в культуре необходимо присутствие

ИЛ-2 в малой концентрации (2 — 10 ед/мл). За

1 ед. принято такое количество интерлейкина-2, которое индуцирует 500(максимального :ключения /3H/-тимидина в

CTLL-клетки в культуре. Количество интерлейкина-2 в 1 мл культуральной среды штамма ВКПМ У1180 составляет более 500 ед.

Таким образом, изобретение позволяет получить штамм S,cåråí!slaå ВКПМ У1180 с выходом по ИЛ-2: 4 мкг/мл, Связывание вещества из культуральной среды штамма

ВКПМ У1180 с антителами к ИЛ-2 свидетельствует о том, что этот штамм можно использовать при разработке иммунодиагностикумов по определению количества

ИЛ-2 в биологических жидкостях. Наличие у вещества биологической активности дает возможность использовать данный штамм при разработке препарата для лечения ряда онкологических заболеваний.

Формула изобретения

Штамм дрожжей Saccharomyces

cerevlslae ВКПМ У1180 — продуцент интерлейкина-2 человека,