Рекомбинантная плазмидная днк @ - @ 2-19, кодирующая синтез интерлейкина-2 человека, способ ее конструирования @ штамм бактерий еsснеriснiа coli - продуцент интерлейкина-2 человека

 

Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности. молекулярной биологии и генно-инженерной биотехнологии. Целью изобретения является повышение уровня накопления интерлейкина-2(ИЛ-2) человека в клетках штамма-продуцента . Методами генной инженерии получена рекомбинантная плазмида pPR-IL2-19, которая обеспечивает регулируемый высокоэффективный синтез интерлейкина-2 человека в клетках E.coli под контролем промоторнооператорной области PROR бактериофага /.. Разработан способ конструирования этой плазмиды. Отобран штамм E.coli ВНИИгенетика VL 903 (pPR-IL2-19) (регистрационный номер ВКПМ В-3866 во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов ), содержащий плазмиду pPR-IL2-19 и продуцирующий интерлейкин-2 человека в количестве 8-10 х 107 международных ед. на 1 л бактериальной культуры, что составляет 12% от суммарного клеточного белка. 3 с.п. ф-лы. 1 ил., 1 табл. На чертеже изображена физическая карта предлагаемой рекомбинантной плазмидной ДНК, Сконструирована новая рекомбинантная плазмида pPR-IL2-19 размером ,85 т.п.н. обеспечивающая экспрессию гена IL2 под контролем регуляторной области PROR . бактериофага А состоящая из большого 1-3,4 т.п.н.) BamHI-Bgfll-фрагмента векторной плазмиды pPR124B и малого (0,45 т.п.н.) С 13-ВдШ-фрагмента плазмиды рАА 1213- 23 (модифицированной введением Bgtll- линкера) и характеризующаяся следующими признаками: содержит участок иници (/) С VJ о со о ю со

СОЮЗ СОВЕ<СКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РFСПУБЛИК

s С 12 N 15/26, 1/21

ГОСУДАРСТВЕ << <ЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕ><ИЯзЛ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4191353/13 (22) 09.02.87 (46) 07.01.92. 6юл. Мт 1 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (72) В,Г.Дебабов, Э.Я.Грен, Ю.И.Козлов, С.В.Машко, А.Я.Стронгин, В.Э.Стеркин, B,Ë.Þðèí, С.В.Костров, А.Ю,Циманис, А.Я.Авот,. Н.В,Романчикова, А.И.Косиков, M,Ý.Òðóõàí, A.В,Мочульский. T.B.×åðíoâская, Е.А.Носовская, М.А.Скворцова и С.М.Мазель (53) 575.224,2.577.2 (088.8) (56) Nucl. Acid. Res., 1983, 11. р. 4307-4323. (54) PЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ

ДI-IK pPR-IL2-19, КОДИРУЮЩАЯ СИНТЕЗ

ИНТЕРЛЕЙКИНА-2 ЧЕЛОВЕКА, СПОСОБ

ЕЕ КОНСТРУИРОВАНИЯ И ШТАММ БАКГЕРИЙ ESCHERICHIA COLI — ПРОДУЦЕНТ

ИНТЕРЛЕЙКИНА-2 ЧЕЛОВЕКА

Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности, молекулярной биологии и генно-инженерной биотехнологии и представляет собой сконструированную in vitro рекомбинантную плазмидную ДНК, обеспечивающую микробиологический синтез интерлейкина2 человека, способ ее конструирования и штамм Е.соИ, содержащий эту рекомбинантную плазмиду — продуцент интерлейкина-2 человека.

Целью изобретения является повышение уровня накопления интерлейкина-2 человека в клетках штамма-продуцента.. Ж 1703693 А1 (57) Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности. молекулярной биологии и генно-инженерной биотехнологии. Целью изобретения является повышение уровня накопления интерлейкина-2(ИЛ-2) человека в клетках штал<ма-продуцента. Методами генной инженерии полу <ена рекомбинантная плазмида pPR-IL2-19, которая обеспечивает регулируемый высокоэффективный синтез интерлейкина-2 человека в клетках Е.coli под контролем промоторнооператорной области pRoR бактериофа<а .

Разработан способ конструирования этой плазмиды. Отобран штамм Е.coli ВНИИгенетика I/L 903 (pPR-IL2-19) (регистрационный номер ВКПМ В-3866 во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов), содержащий плазмиду pPR-IL2-19 и продуцирующий интерлейкин-2 человека в количестве 8-10 х 10 международных ед.

7 на 1 л бактериальной культуры, что составляет 12 от суммарного клеточного белка.

3 с. и, ф-лы. 1 ил„1 табл.

На чертеже изображена физиче<:кая карта предлагаемой рекомбинантной плазл<идной ДН К.

Сконструирована новая рекомбинан тная плазмида ppR- <з-19 размером =3.85т.п.н., )ие обеспечивающая экспрессию гена IL2 под контролем регуляторной области pRoR . бактериофага Я, состоящая из большого

<-3,4 т.п.н.) BamHI-Bg(II-фрагмента векторной плазмиды pPR124B и малого (0,45 т.п.н.)

Cfr13-Bgtll-фрагмента плазл<иды рАА 121323 (модифицированной вве„-ением Bglllлинкера) и характеризующаяся следующими признаками: содержит участок ин <ци1703693

30

40

50

55 ации репликации (Ori) (ColEI-репликон), ген темпера урочувствительного репрессора

cits 857 фага Л, ген устойчивости к ампициллину (Ар ), тандем р -независимых терминаторов транскрипции фага fd (tfd), регулярную область pROR, SD-последовательность (SDcro) и ATG-инициирующий кодон (f-Met) гена сго фага Л, кодирующую последовательность зрелого интерлейкина2 человека; соединение регуляторной области ряов и ATG-кодона, f-Мет гена сго с последовательностью гена IL2 и терминаторами транскрипции И (tfd) осуществлено так, что образован гибридный участок связывания рибосом, имеющий следующую нуклеотидную последовательность 5— ..,TAAGGAGGTTGTATGGCC...-3, где

TAAGGAGGT u ATG-SD-последовательность и инициирующий кодон гена cro соответственноо, G CC — первый (Ala) кодон интерлейкина-2, а эа терминирующим кодоном гена

IL2 расположен тандем р-независимых терминаторов транскрипции fd (tfd); имеет уникальные участки узнавания рестриктаз

Clal. координата которого является началом отсчета (О) на чертеже, Xbal (= 990), Bg(II (1250), Pstl (= 3070).

Способ конструирования рекомбинантной плаэмиды pPR-IL2-19 заключается в том, что в состав плаэмиды рАА1213-23 вводят с помощью олигонуклеотидного линкепа уникальный участок расщепления для стриктазы Bgtll в 3 -нетранслируемую ,сть гена Il 2, затем полученную таким обрззом плаэмиду рАА1213-23В обрабатывают рестриктазой Cfr 13 и достраивают образующиеся однонитевые концы молекул

ДНК Кленовским фрагментом ДНК-полимераэы I Е.coli, после чего фрагмент с геном интерлейкина интегрируют с помощью

ДНК-лигазы фага Т4 в состав векторной молекулы pPR 1 24В, расщепленной рестриктазой ВагпН!исудаленными 51-зндонуклеазой однонитевыми концами ДНК, затем препарат обрабатывают рестриктазой Bgtll u обеспечивают циклиэацию линейных молекул ДНК ДНК-лигазой Т4. полученной смесью трансформируют клетки Е.coli С600, трансформанты высевают на среду с ампициллином и культивируют при 28 С с последующей селекцией на пониженную скорость роста при 42 С. Из отобранных таким образом клонов выделяют плазмидную ДНК, обозначенную как pPR-IL2-19, в которой точность воссоединения фрагментов проверяют восстановлением на стыке исходных участков ДНК ранее отсутствующей последовательности узнавания рестриктазы BspRI.

Выбор метода селекции рекомбинантных клонов основывается на известных данных о возможном токсическом действии некоторых белков зукариотического происхождения при их суперпродукции в бактериальных клетках в условиях дерепрессии промотора, регулирующего транскрипцию чужеродного гена.

Штамм Е.coli ВНИИгенетика VL 903 (pP R-IL2-19) (регистра цион ны и номер В КП М

В-3866 во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов) — продуцент интерлейкина-2 человека.

Штамм получают трансформацией реципиентного штамма Е.coli ВНИИгенетика

М 903 рекомбинантной плазмидой pPR-IL219 с последующим отбором рекомбинантных клонов на среде с ампициллином при

28 С и определением активности интерлейкина-2. Активность определяют стандартными методами по поддержанию роста интерлейкин-2-зависимой.культуры CTL2 цитотоксических лимфоцитов мыши, B качестве стандарта используют природный интерлейкин-2 человека с активностью 11 международных ед. на

1 мл в экстрактах клеток трансформантов после дерепрессии pR промотора, достигаемой культивированием штамма в течение

1 — 2 ч при 42 С. В качестве реципиента могут быть также использованы штаммы Е.coli

С600, НВ101, TGI, VL902 и другие проиэюдные Е.coli К12.

Штамм Е.coli ВНИИгенетика И 903 (pPR-IL2-19) характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки: клетки прямые, палочковидные, слабоподвижные. способны к образованию нитевидных форм. грамотрицательные, неспороносные, размер отдельных клеток 3-5 мкм.

Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на плотных и жидких простых синтетических, полусинтетических и комплексных средах. При росте на агаризованном бульоне Хоттингера или L-бульоне образуют гладкие, круглые. слабоматовые. ослизненные колонии. При выращивании в жидких средах типа бупьо,ia или М9 с казаминовыми кислотами образуют равномерную взвесь.

Физиолого-биохимические признаки.

Клетки способны к росту в диапазоне 540 С (оптимум 37 С) при рН 6,7-7,5. В качестве источника углерода используют углеводы (например, сахарозу) и аминокислоты. Обладают ауксотрофностью по метионину. Источником азота могут служить минеральные соли в аммонийной форме, а также органические соединения в виде пеп1703693 тона. триптон . дрожжевого экстракта аминокислот.

Устойчивость к антибиотикам. Штамм устойчив к ампициллину в концентрации до

100 мг/n при выращивании в жидких и на агаризованных питательных средах.

Стабильность плазмиды. При хране ии клеток на агаризованной среде, при серии последовательных пересевов и в процессе глубинного культивирования в жидкой среде с антибиотиком не происходят потери и перестройки плазмиды, Пример 1. Конструирование рекомбинантной плаэмиды pPR-IL2-19, Получение целевой плазмиды, обеспечивающей синтез интерлейкина-2 человека, проводят в несколько этапов, заключающихся в создании промежуточной плазмиды рАА1213-238 и последующего конструирования рекомбинантной плазмиды p P R-I L2-19.

3 мкг ДНК плаэмиды рАА 1213-23 расщепляют в 10 ед. рестриктазы Stul в пробе объема 30 мкл, содержащей буфер для рестрикции- (10 мМ трис-HCI рН 7,9, 6 мМ

М9С!г, 6 мМ 2-меркаптоэтанол, 150 MM

NaCI), далее ДНК осаждают из реакционной смеси добавлением этанола. Осадок отделяют центрифугированием в 20 мкл Н О. Воссоединение линеаризованной плазмидной

ДНК с Bg(ll-линкерами "Collaborative Research" проводят с помощью 20 ед. ДНКлигазы Т4 в пробе объемом 30 мкл, содержащей буфер для лигирования (60 мМ трис-HCI, рН 7,6, 10 мМ MgClz, 10 мМ 2меркаптоэтанол, 0,4 мМ (АТФ), 2 мкг плазмидной ДНК и 0,5 мкг линкеров.

После лигирования ДНК из реакционной смеси осаждают этанолом, растворяют и подвергают ферментативному гидролизу рестриктазой Bg(ll в пробе объемом 40 мкл, содержащей буфер для рестрикции-2 (6 мМ трис-HCI, рН 7,6, 6 мМ Mg Clz, 6 MM 2-меркаптоэтанол, 50 мМ NaCI). ДНК вновь осаждают этанолом, растворяют и обеспечивают циклизацию молекул ДНК. для чего 1 мкг препарата плазмидной ДНК в 240 мкл буфера для лигирования обрабатывают 2 ед.

ДНК-лигазы Т4. Полученной смесью трансформируют клетки Е.coli С600. Эффективность трансформации составляет до 5.10 колоний на 1 мкг нативной плазмиды рАА1213-23. Отбирают клоны, устойчивые к ампициллину (100 мкг/мл). из них выделяют плазмидную ДНК llo модифицированному методу Бирнбойма и Доли, используют ее для рестрикционного анализа. Полученная таким образом плазмида рАА1213-238 в отличие от исходной рекомбинантной молекулы рАА1213-23 содержит

55 уникальный участок расщепления Г,< И! вместо имевшейся посл едовател ь;, з. а сонияя Stul.

30 мкг ДНК плазмиды рАА12 ..- B расщепляют рестриктазой Cff 1: . . и ед а,:тивности) в пробе обье;с " мкл содержащей буфер для рест, ... л 1 Продукты ферментативного гидролиза подвергают электрофорезу в 1,1 = -ном rene легкоплавкой агарозы в трис-ацетатной буферной системе при напряженности поля 5 В/см. Зону геля, содержащугс фрагмент

ДНК длиной =750 п.н., вырез .oò и проводят элюцию ДНК. Для достройки о,;ноцепочечных концов ДНК с помощью Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I F со выд..ленный из геля фрагмент обоа,.-; .u,ают в пробе объемом 20 мкл, содержа .ей 10 мМ трис-HCI, рН 8,0, 10 мМ MgCI:, по 30 мкМ дезоксирибонуклеозидтрифосфатов. Реакцию останавливают прогреванием, ДНК из смеси переосаждают этанолом и растворяют в 20 мкл, Полученный препарат фрагмента плазмиды рАА1213-23В используют на дальнейших этапах конструирования для интеграции кодирующей части интерлейкина-2 человека в векторную плазмиду

pBR124B.

3 мкг ДНК плазмиды pBR124B расщепляют рестриктазой BamHI в пробе обьемс .

12 мкл, содержащей буфер для рестрикци:Реакцию останавливают фенольной депротеинизацией ДНК и переосаждением нуклеиновой кислоты этанолом. Осадок растворяют в 20 мкл Н>0. Удаление образующихся при расщеплении ДНК рестриктазой одноцепочечных концов осуществляют при помощи Sl-эндонуклеаэы. Для этого ДНК гидролизуют 30 ед. S1-эндонуклеазы в пробе объемом 50 мкл, содержащей 30 MM

СНзСООМа, рН 4,4, 4,5 мМ Zr SO>. 250 мМ

NaCI в течение 20 мин при 20 С Реакцию останавливают обработкой фенолом и jHK переосаждают этанолом. Осадок раствэряют в 15 мкл Н20.

Полученный таким способом препарат линеаризованной плазмиды pBR124Â воссоединяют с фрагментом плазмиды рАА1213-23В, выделение которого указано

Для этого 1 мкг плазмидной ДНК и 2 мкг фрагмента обрабатывают ДНК-лигазой фаза Т4 в буфере для лигирования при объеме реакционной смеси 30 мкл. После переосаждения ДНК и растворения осадка в

20 мкл Н20 препарат обрабатывают рестриктазой В96! указанным образом. ДНК еще раз осаждают этанолом, растворяют и обеспечивают воссоединение линейных молекул ДНК в кольцевые формы с помо цью

1703693

ДНК-лигазы Т4 при обработке препарата ферментом в объеме реакционной смеси

300 мкл. Полученный препарат используют для трансформации клеток Е.coli С600 с последующей селекцией трансформантов на среде с ампициллином при культивировании клеток в течение суток при 28 С, Среди полученных трансформантов отбирают варианты, обладающие пониженной способностью к росту при 42 С. Из указанных клонов выделяют плаэмидную ДНК и подвергают рестрикционному анализу. В полученной плазмиде pPR-IL2-19 на стыке соединяемых участков ДНК, кодирующих первый кодон гена cro фага А и Ala-кодон интерлейкина-2 человека, образуется участок расщепления рестрикционной эндонуклеаэы BspRl, Пример 2. Получение штамма E coli

ВНИИгенетика VL 903 (pPR-11 2-19) — продуцента интерлейкина-2 человека.

Плазмиду pPR-И 2-19, кодирующую синтез интерлейкина-2 человека, трансформацией (пример 1) вводят в клетки штамма реципиентного E.coli ВНИИгенетика 1/1 903 из коллекции ВНИИгенетики (регистрационный номер ВКПМ В-3546 во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов). Эффективность трансформации клеток

E,coli B H ИИгенетика VL 903 составляет около

10 клонов на 1 мкг нативной плазмиды pPRIL2-19. Трансформанты отбирают на среде, содержащей ампициллин (100 мкг/мл) после культивирования клеток в течение суток при 28 С. Из отобранных клонов выделяют плазмидную ДНК и подтверждают ее идентичность препарату pPR-IL2-19 с помощью рестрикционного анализа. Полученный штамм Е,coli ВНИИгенетика Ч1 903 (pPR-IL2-19) депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов и имеет регистрационный номер ВКПМВ-3761.

Пример 3. Получение штамма Е.coli

ВНИИгенетика Ч1 903 (pPR-И 2-19).

Все операции осуществляют в соответствии с примером 2, Отличие состоит в том, что в качестве реципиента при трансформации используют штамм Е.coli ВНИИгенетика VL 902 и в результате трансформации клеток этого реципиента плазмидой pPRIL2-19 получают штамм Е.coli ВНИИгенетика Ч1 902 (pPR-IL2-19) — продуцент интерлейкина-2 человека.

Пример 4. Получение штамма E coli

С600-htpR (pPR-И 2-19).

Все операции осуществляют в соответствии с примером 2. Отличие состоит в том, что в качестве реципиента используют штамм Е.coli С600-thpR, несущий дополни5

55 тельно хромосомальную мутацию в гене

htpR. В результате трансформации клеток этого реципиента плазмидой pPR-IL2-19 получают штамм Е,cali С600-htpR (pPR-IL219) (ВКПМ В-3828) — продуцент интерлейкина-2 человека.

Пример 5. Определение продуктивности штаммов Е.coli (pPR-IL2-19) — продуцентов интерлейкина-2 человека.

Для определения продуктивности штаммов плазмидсодержащие клетки выращивают при 28 С на скошенной агариэованной среде Хоттингера, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, в течение 14 ч. Выросшую на косяках биомассу используют для получения посевного материала. Для этого клетки переносят в колбы Эрленмейера объемом 750 мл со 100 мл среды Хоттингера, со 100 мкг!мл ампициллина и выращивают при 28 С на качалке при 240 об/мин в течение 6 ч. Оптическая плотность посевной культуры состаsnяет 1,5 — 2,5 ед.

Ферментацию проводят в ферментере, оснащенном системами регулирования рН, температуры. скорости перемешивания и аэрации. Для ферментации используют среду Хоттингера со 100 мкг/мл ампициллина и

10 г/л глюкозы. Посевную культуру вносят в количестве 5 — 10 . Культивирование осуществляют при рН 6, 6-6,8, поддерживая этот уровень подачей аммиачной воды. Первую часть ферментации до О. Д55о = 3,5 проводят при 28 С, а затем осуществляют термоиндукцию, повышая температуру до 42-45 С в течение 5 мин, после чего продолжают ферментацию еще 2 ч.

После окончания процесса для определения активности интерлейкина-2 человека из 1 мл культуральной жидкости клетки осаждают центрифугированием и осадок ресуспендируют в 1 мл 8 M раствора гуанидинхлорида при 20 С в течение 40 мин или

1 -ном растворе додецилсульфата натрия в

0,02 M фосфатном буфере рН 7,2, содержащем 1 2-меркаптоэтанола. В последнем случае образцы прогревают 2-4 мин при

100ОС. Осадок отбрасывают центрифугированием и определяют активность содержащегося в надосадочной жидкости фракции интерлейкина-2.

Для определения доли синтезированного интерлейкина-2 человека от суммарного клеточного белка клетки из 1 мл культуральной жидкости осаждают центрифугировзнием и обрабатывают указанным образом.

Препарат анализируют электрофорезом в

15%-ном полиакриламидном геле в присутствии 0,1 додецилсульфата натрия. Белки, разделенные в геле, прокрашивают в растворе Кумасси R-250. Количественное со1703693

10 держание белков в зонах определяют после сканирования прокрашенного геля на автоматическом лазерном денситометре.

Идентификацию зоны, соответствующей синтезированному в клетках зрелому интерлейкину-2 человека, проводят на основе срав»ения с злектрофоретической подвижностью маркерных белков, а также с помощью блоттинга разделенных белков на нитроцеллюлозные фильтры с последующим проявлением зон интерлейкина обработкой в растворах, содержащих мышиные моноклональные антитела против интерлейкина-2 и антимышиные кроличьи антитела, конъюгированные с пероксидазой из хрена. После соответствующей процедуры окрашивания зона интерлейкина проявляется в виде Ко ричневой полосы на неокрашенном фоне нитроцеллюлозного фильтра.

Биологическая активность интерлейкина-2 человека в различных плазмидных штаммах Е.coli — продуцентах интерлейкина, а также доля синтезированного в клетках белкового продукта гена П 2 от суммарного белка представлены в таблице.

Таким образом, изобретение позволяет повысить продукцию интерлейкина-2 до 810 х 10 м- кдународных ед. на 1 л бактери7 альной культуры, что составляет 12 (, от суммарного клеточного белка.

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плаэмидная ДНК

pPR-IL2-19, кодирующая синтез интерлейкина-2 человека, размером 3.85 т.п.н., содержащая BamHI-Bgfil-фрагмент векторной плазмиды pPR 124В размером 3,4 т.п.н., Cfr 13-Bgfl>-фрагмент размером 0,45 т.п.н. плазмиды рАА1213-23, модифицированный введением В9Р1 -линкера, ColEI-репликон, ген температурочувствительного репрессора с its 857 фага Я, ген устойчивости к ампициллину. тандем р -независимых терминаторов транскрипции фага fd, регулярную область pRoR, SD-последовательность, ATG-инициирующий кодон гена cro фага 1, кодирующую последовательность зрелого интерлейкина-2 человека гибрид5

45 ный участок связывания рибосом, имеющий следующую нуклеотидную посл едовательность; 5 ... TAACCACCTTCTATCCCC...З . где

TAAGGAGGT u ATG — SD-последовательность и индуцирующий кодон гена сго соответственно, GCC-первый (Ala) кодон интерлейкина-2, а за терминирующим кодоном гена IL2 расположен тандем р -независимых терминаторов транскрипции fd, уникальные участки узнавания рестриктаз: Clal, координата которого является началом отсчета -О, Xbal — 990 т.п.н., Bgtil — 1250 т.п,н., Рвт — 3070 т.п.н, 2. Способ конструирования ре комбинантной плаэмидной ДНК pPR-IL2-19, заключающийся в том, что введение уникального участка расщепления Bgtil в 3

-концевую нетранслируемую часть гена IL2 в составе плазмиды рАА1213-23 осуществляют с помощью олигонуклеотидного линкера, полученную плаэмиду расщепляют рестриктазой Cfr 13 и достраивают образующиеся однонитевые концы молекул ДНК фрагментом Кленова ДНК-полимераэы 1

Escherichia coll, образованный фрагмент плазмиды рАА1213-23В с геном! 1 2 интегрируют с помощью ДНК-лигазы фага Т4 в состав векторной молекулы pPR124B. предварительно расщепленной BamHI ii обработанный S1-эндонуклеаэой. Затем препарат ДНК обрабатывают рестриктазой

В9(1! и соединяют молекулу ДНК в кольцевую форму ДНК-лигаэой, полученной смесью трансформируют клетки Е.coll С600, трансформанты высевают на среду с ампициллином и культивируют при 28 С с последующей селекцией на пониженную скорость роста при температуре 42 С, иэ отобранных клонов выделяют плаэмиду

pPR-IL2-19, в которой точность воссоединения фрагментов проверяют восстановлением на стыке исходных участков ДНК, ранее отсутствовавшей последовательности узнавания рестриктаэы BspRI.

3, Штамм бактерий Escherichia coli

ВКПМ В-3866 — продуцент интерлейкина-2 человека.

1703693

Sacro

f-met

CLaI

ccrc

Составитель Т, Забойкина

Техред М.Моргентал Корректор Т Малец

Редактор И, Шулла

Заказ 40 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035. Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", с. Ужгород, ул.Гагарина, 101 тамм реципиент плээмидыТ Биологическая активность

Доля интерлейкина от син зируемого в клетках белка