Способ получения креатинамидиногидролазы

 

Изобретение относится к генетической инженерии и касается получения креатинамидиногидролазы, которая стабильнее, чем нативный фермент, и поэтому более пригодна для определения содержания креатинина в сыворотке, плазме или моче. Целью изобретения является повышение стабиль1- ности фермента. Конструируют плазмиды рВТ 109 и рВТ 119, содержащие ген креатинамидиногидролазы. в котором произошла аминокис потная замена в положении 109, а в случае рВТ 119 также в положении 355 - замена Val на Met. Благодаря секвенсированию рВТ 119 установлено, что в положении 1063 последовательности в кодирующей нити G заменена A/G - А/ так, что триплет СТА превращен вАТб. В результате трансформации штаммов-реципиентов полученными плазмидами созданы штамм Е. col DSM 4105, содержащий плазмиду р ВТ 109 и штамм Е. col I DS М 4106, соде ржащий плазмиду рВТ 119, конститутивно экспрессирующие креатинамидиногидролазу. 4 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (si)s С 12 N 15/26, 9/78

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 4355715/13 (22) 11.05.88 (31) Р 3715841.4; (32) 12.05.87 (33) DE (46) 30.04,92. Бюл. М 16 (71) Берингер Маннхайм ГмбХ (DE) (72) Гюнтер Шумахер и Петер Букель (DE) (53) 575.224,2.547.2 (088,8) (56) ДЕ М 3500184, кл. С 12 М 15/00, 1986, (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КРЕАТИНАМИДИНОГИДРОЛАЗЫ (57) Изобретение относится к генетической инженерии и касается получения креатинамидиногидролазы, которая стабильнее, чем нативный фермент, и поэтому более пригодна для определения содержания креатинина в сыворотке, плазме или моче. Целью

Изобретение относится к генетической инженерии и касается получения креатинамидиногидролазы, которая стабильнее, чем нативный фермент, и поэтому более пригодна для определения содержания креатинина в сыворотке, плазме или моче.

Фермент креатинамидиногидролаза ЕС

3.5.3,3 находит промышленное применение для определения креатинина, Его используют для диагноза заболеваний почек, при которых в сыворотке или моче содержание креатинина отклоняется от таковых здорового организма.

Известны микроорганизмы, которые при индукции за счет креатина в состоянии

„„5U„„1731066 АЗ изобретения является повышение стабиль ности фермента. Конструируют плазмиды рВТ 109 и рВТ 119, содержащие ген креатинамидиногидролазы, в котором произошла аминокисчотная замена в положении 109, а в случае рВТ 119 также в положении 355— замена Val Hà Met. Благодаря секвенси. рованию рВТ 119 установлено, что в положении 1063 последовательности в кодирующей нити 6 заменена А/6 -+ А/ так, что триплет GTA превращен в ATG. В результате трансформации штаммов-реципиентов полученными плазмидами созданы штамм

Е. coll DSM 4105, содержащий плазмиду рВТ 109 и штамм E. coll DSM 4106, содержащий плазмиду рВТ 119, конститутивно экспрессирующие креатинамидиногидролазу, 4 табл.

6д вырабатывать креатинамидиногидролазу в @ достаточном для переработки количестве, (Однако достигаемый выход и стоимость О фермента представляют собой лимитирую- О щий фактор для промышленного применения фермента.

Известен также способ получения данного фермента, при котором удалось выделить ген, кодирующий креатинамидиногидролазу из Pseudomonas

putlda, клонировать его рВР 322. После трансформации микроорганизмов вида E.

coll или полученной рекомбинантной ДНК удалось получить конститутивно креатинамидиногидролазу.

1731066

Этот способ с помощью генной инженерии креатинамидиногидролаэы эффективнее и легче в осуществлении, чем выделение из индуцированного, не содержащего никакого плазмида микроорганизма.

Однако получаемый с помощью данного способа фермент естественного типа обладает только ограниченной детергентной и термической стабильностью и, таким образом, оптимально непригоден для использования в клиническом тест-способе.

Цель изобретения — повышение стабильности фермента.

Получены креатинамидиногидролазы, которые каталиэируют реакцию:

Креатин + kzO - саркозин + мочевина.

В отличие от нативного фермента в полученном белке происходит замена аминокислоты в положении 109. Аминокислота аланин заменяется валином. Полученный фермент обладает нэмного лучшей стабильностью, чем нативный фермент.

Сконструированы плазглиды рВТ 109 и рВТ 119, содержащие ген креатинамидиногидролазы, в котором произошла аминокислот эя замена в положении 109, а в случае рВ1 119 также в положении 355 заменена

Val u Met. Благодаря секвенсированию рВТ

119 установлено, что в положении 1063 последовательности в кодирующей нити О заменен на А (G -- А). так что триплет GTG превращен в АТ6. В результате трансформации штаммов рецинентом полученными плазмидэми созданы штэммы Е. соИ, 0$М

4105. содержащие плаэмиду рВТ 109, и штамм Е. coll, DSM 4106, содержащий плазмиду рВТ 119, конститутивно зкспрессирующие креатинамидиногидролазу, Пример 1. Клетки Е. coll DSM 4105, Е. соИ DSM 4106 и для сравнения Е. соИ DSM

3143 выращивают в течение ночи в ферменторах на 1 л.

Среда — полная (дрожжи, пентоновый экстракт); 0,4 глюкозы; 1.00 ммоль/л фосфатного буфера.

После 15-минутного центрифугирования при 8000 об/мин клетки переводят в удобную для переработки форму в Frenchnpecce и креатинамидиногидролазу очищают путем фракцини рова ния через молекулярное сито (Софакрил $200). Полученные ферменты инкубируют при указанных в табл. 3 условиях и затем

50 осуществляют определение фермента при применении тест-комбинации "Мочевина" (ВМ определение В 124770, табл. 4).

Табл. 1 воспроизводит характер стабильности предлагаемых в изобретении муТ3НТоВ креатинамидиногидролазы Ilo сравнению с ферментом полученным способом-прототипом при 37 С, причем тестсмесь 1 иэ тест-комбинации

"креатинин-PAP" (ВМ вЂ” определение М 839

434); исходная активность: t2 V (мл) = 100 .

Результаты сравнения констант

Mlchaelts (KM) при 37 С, 0,1 моль/л TpuoHCl, рН 8,0 (оптимальные тест-условия) приведены в табл. 2.

Тест-условия; фосфатный буфер 20 ммоль/л; рН 8,0;

Нативная креатинамидиногидролиза

1,05 мг белка/мл (8,0 V/мг), Полученная креатинамидиногидролаза

1,10 мг белка/мл (8,7 V/мг), (аминокислота .

109 = Vai)

Фермент инкубируют при указанных тест-условиях и затем осуществляют определение фермента при тест-комбинациях

"Мочевина" (BM определение М 124770).

Полученный фермент обладает большей стабильностью и с помощью данной креатинамидиногидролазы можно избежать потерь активности фермента при определении креатинина и осуществлять надежно такие определения также через более длительные промежутки времени, на основании улучшенных свойств также возможно уменьшение количества фермента в креатинин-тесте.

Формула изобретения

Способ получения креатинамидиногидролазы, предусматривающий конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей креатинамидиногидролазы, трансформацию полученной ДНК штамма бактерий Escherlchla coll, культивирование трансформированного штамма, выделение и очистку целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения стабильности фермента, конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК рВТ 109 или рВТ

119, трансформации подвергают штамм

Е.coll DSM 4105, или 0$М 4106, при этом плазмидой трансформируют штамм Е. соИ

DSM 4105, а плазмидой рВТ 119 — штамм Е.

coll 4106.

1731066

Таблица 1

Стабильность полученной креатинамидиногидролазы по сравнению с известным ферментом

Таблица 2

Константа Михасталиса ферментов

КП1, ммоль/л

Креатинамидиногидролаза из Е. coll (кодирующий плазми

Таблица 3

Определение остаточной активности фермента при оптимальных условиях при различных температурах

Таблица4 ь

Определение фермента при 37 С

Тест-условия

Вреня, мин

Тест-сиесь 1 из тест-комбинации

3,3 Ч/мп (активность 100ь) Креатинин-PAP (Вн Н 839434) 3,0. Ч/мл (остаточная активность * 1002) 1„9 Ч/мп (остаточная актив" ность = 592) 15

0,6 v/èë (остаточная активность 1вь) 30

В 125 ммоль|л фосфатного буфера Т детергент

0,2 V/ìë (остаточная активность 62) 3,3 Vlìï (актнвность « 100 2) 2,7 Ч/мп (остаточная активность 91ь) 15 0>7 Ч/мп (остаточная активность - 212) 2,7 Ч/ил (остаточная активность 913) 0,0 V/ìë (остаточная активность Оь) 30

2,1 V/ìë (остаточная активность 71а) 0,0 Ч/мп (остаточная активность Оь) П р и и е ч а н и е: ферменты инкубируют при указанных условиях и затем осуществляют опре" деление Фермента при применении тест-комбинаций,нМочевинан . (ВИ определение V 124770).

DSM 3143 (рВТ2а-1 DSM 3148 P)

DSM 4105(рВТ 109 DSM 4108 P)

DSM 4106 (рВТ 119 DSM 4107 Р) Креатинамидиногидропаза ьс-типа (патент ФРГ Ь 3500184 Аl) (ДВ11 3143)

Сравнение

Креатинамиднногидропаза мутанта (аминокислота 109та1) (ДЯИ 4105)

Согласно изобретению

3,0 Ч/мл (актмвность 1002) 2,7 V/мп (остаточная активность 91 ь)

2 ° 5 V/èë (остаточная активность)

3,0 Ч/мл (активность 100ь) 25

1 6