Способ выявления сериновых протеаз в слезной жидкости при хронических язвах роговой оболочки глаза

 

Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и может быть использовано для определения сериновых протеаз в слезной жидкости при хронических язвах роговой оболочки глаза. Цель изобретения заключается в ускорении и повышении точности определения протеаз в слезной жидкости. Сущность изобретения состоит в том, что протеолитическую активность исследуемого материала определяется спектрофотометрически по скорости расщепления синтетического субстрата э гилового эфира N-« -бензоил-аргинина, после чего измеряется остаточная активность в присутствии специфических ингибиторов сериновых протеаз: с-аминокапроновой кислоты, ингибиторов трипсина из бобов сои или гордокса, и определяется относительное содержание плазмина и его активаторов, а также тканевого и плазменного каллекреинов по уровню остаточной активности. Способ ускоряет измерение протеолитической активности с 24-48 ч до 9-15 мин и позволяет количественно определять активности плазмина и его активаторов, а также тканевого и плазменного каллекреинов. 1 табл (Л С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (5!)5 G 01 N 33/487, 33/74

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4487823/14 (22) 28.09.88 (46) 23,10.91. Бюл. М 39 (71) Центральный институт усовершенствования врачей (72) В.Л.Доценко, P.È.Íàõèêÿí и Г.А.Яровая (53) 612.015(088.8) (56) Salunen Е.-M, Тегчо Т, То ггла Е, Tarkkanen А, сапегу А-Асса Ophthalmol 1987, v 6655, р. 3 — 12. (54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ СЕРИНОВЫХ

ПРОТЕАЗ В СЛЕЗНОЙ ЖИДКОСТИ ПРИ

ХРОНИЧЕСКИХ ЯЗВАХ РОГОВОЙ ОБОЛОЧКИ ГЛАЗА (57) Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и может быть использовано для определения сериновых протеаз в слезной жидкости при хронических язвах роговой оболочки глаза. Цель изобретения заключается в ускорении и по, Изобретение относится к области медицины, в частности к офтальмологии, а именно к способам диагностики ферментных факторов, способствующих развитию хронических язв роговой оболочки глаза.

Целью изобретения является повышение точности и ускорение способа.

Способ осуществля ют следующим образом.

Отобранные у больных образцы слезной жидкости (50 — 70 мкл) помещают в пластико- вые пробирки с герметически закрывающимися крышками и хранят до исследования при -20 С, Допустимо одноразовое замораживание и оттаивание образцов.

Затем в 5 — 10 мкл слезной жидкости определяют общую активность ферментов, „„Я „„1686359 А1 вышении точности определения протеаз в слезной жидкости. Сущность изобретения состоит в том, что протеолитическую активность исследуемого материала определяется спектрофотометрически по скорости расщепления синтетического субстрата — этилового эфира N-Q -бензоил-аргинина, после чего измеряется остаточная активность в присутствии специфических ингибиторов сериновых протеаз: я-аминокапроновой кислоты, ингибиторов трипсина из бобов сои или гордокса, и определяется относительное содержание плазмина и его активаторов, а также тканевого и плазменного каллекреинов по уровню остаточной активности. Способ ускоряет измерение протеолитической активности с 24-48 ч до 9-15 мин и позволяет количественно определять активности плазмина и его активаторов, а также тканевого и плазменного каллекреинов. 1 табл. расщепляющих этиловый эфир N-a-бензоиларгинина (БАЭЭ-эстеразную активность), Для этого образец помещают в кварцевую IG спектрофотометрическую кювету, забуфе- Ы ривают 0,1 мл 0,5М три -HCI буфера, рН 8,0 и (Я доводят объем до 2 мл подогретым до 37 С О

0,05М трис-HCI буфером, рН 8,0, После этого в кювету добавляют 1 мл 1,5 х10 М раствора этилового эфира N-а -бензоил-аргинина (БАЭЭ) и начинают измерять прирост оптической плотности при 253 нм при 37 С. При отсутствии активности объем пробы следует увеличить. Оптическим контролем служит проба, содержащая 2 мл 0,05 M трис-HCI буфера, рН 8,0 и 1 мл субстрата.

Расчет активности проводят по формуле

ЛA2,73

tv где ЛА — прирост оптической плотности за время регистрации, 2,73 — пересчетный коэффициент, учиты- 5 вающий разницу молярных зкстинций субстрата и продукта реакции; t — время регистрации оптической плотности; v — объем исследуемого образца, мл. Анализ действия ингибиторов на БАЭЗ-эстеразную актив- 10 ность слезной жидкости производят следующим образом.

Готовят растворы,ингибиторов: ингибиторы трипсина из бобов сои -ИТС (2 мг/мл), е-аминокапроновая к:ислота — E -АКК (20 15 мг/мл). В качестве тканевого ингибитора протеолитических ферментов используют коммерческие препараты Гордокс ("Гидеон

Рихтер", Венгрия).

К 5 — 10 мкл образца слезной жидкости 20 добавляют 0,1 мл 0,5 М трис-НCI буфера, рН

8,0, и 0,1 MR одного иэ ингибиторов. Через

15 мин инкубации объем пробы доводят до

2 мл подогретым до 37"С 0,05 M трис-HCI буфером и после внесения 1 мл 1,5 х 10 M 25

-з раствора БАЭЗ начинают измерять БАЭЭэстераэную активность. Регистрацию оптической плотности пробы проводят каждые 3 мин в течение 9 — 15 мин, Расчет активности ведут по той же формуле, после чего рассчи- 30 тывают ингибирование в процентах.

Повторяют измерение с другими ингибиторами по приведенной схеме.

Исходя иэ подавления общей БАЭЗ-эстеразной активности ингибиторами, устанавли- 35 вают соотношение между активностью плазмина, тканевого и плазменного калликреинов и других протеинаэ, Данные о действии применяемых ингибиторов приведены в таблице, 40

Пример 1. Обследован 21 больной с диагнозом хроническая язва роговой оболочки глаза, из них -- 12 женщин и 9 мужчин в возрасте от 45 до 68 лет.

Общая БАЭЗ-зстеразная активность 45 колеблется в значительных пределах; от

0,012 до 3,03 мкмоль/мл сл.ж. Доля активности, чувствительная к действию г-АКК, варьирует в отдельных образцах от 9 до 90%, что свидетельствует о различной активности 50 плазмина в образцах, Доля активности, чувствительная к дейс.гвию ИТС, варьирует в исследованных образцах от 43 до 74%, что доказывает факт неодинакового содержания в слезной жидкости больных тканевого кал- 55 ликреина и активаторов плазмина. Препарат трасилола, аналог Гордокса, подавляет активность на 80 — 100%, -:Tо также свидетельствует о разном содержании в слезной жидкости больных активаторов плазмина.

Пример 2, Проведено обследование больной с диагнозом; кератит герпетический, вторичная язва роговой оболочки. К 5 мкл слезной жидкости больной добавляли

0,1 мл 0,5М трис-HCI буферного раствора, рН 8,0, доводили объем до 2 мл подогретым до 37 С 0,05 M трис-HCI буфером, рН 8,0, добавляли 1 мл субстрата (БАЭЗ) и измеряли увеличение плотности пробы на спектрофтометре Хитачи -3200 при длине волны

253 нм. Отсчеты оптической плотности производились автоматически каждые 3 мин в течение 9 мин. Оптическая плотность возрастала эа 9 мин на 0,025, что соответствовало активности 1,57 мкмоль БАЭЗ в мин на 1 мл образца, 0,1 мл раствора я-АКК добавляли к 5 мкл слезной жидкости, эабуференной 0,1 мл 0,5

М трис-HCI буфером, инкубировали 15 мин при 37 С, после чего измеряли оставшуюся

БАЭЭ-эстераэную активность, Активность после действия к-АКК составляет 1,43 мкмоль/мин на мл (заингибировано 8,9%), активность после действия ИТС -0,41 MKMoRb/Mèí (заингибировано 73,9%), гордокс полностью подавляет активность образца. Следовательно, активность плаэмина в образце слезной жидкости составляет около 10%, а активность тканевого калликреина — более 25%. Вывод; для лечения могут быть рекомендованы инстилляции гордокса и хелирующих агентов.

Пример 3. Проведено обследование больного с диагнозом: хроническая язва роговой оболочки.

Общая активность слезной жидкости—

3,03 мкмоль/мин на мл е-АКК подавляла активность на 78%, а ИТС - на 73%, Вывод: для лечения могут быть рекомендованы инстилляции раствора r.-ÀÊÊ и хелирующих агентов, Способ является количественной методикой измерения активностей ферментов, в отличие от способа-прототипа, ограничивающегося полуколичественным методом (измерение диаметра пятна и пересчет активности по калибровочной кривой), а также позволяет измерить активность тканевого и плазменного каллекреинов, что увеличивает точность метода.

Предложенный способ значительно ускоряет измерение протеолитической активности слезной жидкости с 24 -48 ч до 915 м н.

Формула изобретения

Способ выявления сериновых протеаз в слезной жидкости при хронических язвах ро1686359

Чувствительноть отдельных ферментов к действию ингибиторов

Составитель А. Скурат

Техред М.Моргентал

Корректор М. Демчик

Редактор Л. Лашкова

Заказ 3594 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент",.г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 говой оболочки глаза, включающий определение протеолитической активности плазмина и его активаторов по расщеплению субстрата, отл и ч а ю щи йс я тем,что, с целью ускорения и повышения точности способа, протеолитическую активность определяют спектрофотометрически по скорости расщепления синтетического субстрата этилового эфира- N — а-бензоиларгинина, после чего измеряют остаточную активность в присутствии е-аминокапроновой кислоты,ингибиторов трипсина из бо5 бов сои или гордокса, и определяют относительное содержание плазмина, его активаторов, тканевого и плазменного каллекреинов.