Способ определения тестостерона в биологической жидкости

 

Изобретение относится к иммунологическому анализу и представляет собой способ количественного определения тестостерона. Цель изобретения - увеличение чувствительности ускорение и упрощение способа. Для этого полимерный носитель перед сорбцией антител обрабатывают белком A S.AUREUS до насыщения. Полученный иммуносорбент используют для твердофазного иммуноферментного анализа тестостерона. Чувствительность определения 8 пг/мл. Время анализа 2 ч 40 мин.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„.ЯО„„И9757

А1 (51)4 G 01 N 33/74

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

3ИИВЗУ

ПАТЕЧБ3- Й:А1.л it Г 14БД119 I Гг ° s

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И OTHPHTHRM

ПРИ fXHT СССР ((21) 4257770/28-14 (22) 08.06.87 (46) 30.07„89. Бюл. У 28 (71) Институт биохимии им, А.Н,Баха (72) Г,Е.Рукавишников, Е.P.Сигал, Б.Б.Дзантиев, А.Л.Лиознер, А.M.Åãîðîâ и И.В.Березин (53) 612.015 (088.8) (56) I.stегоid Biochem, 1983, v.19.

Л 1, р. 419-421„ (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТЕСТОСТЕРОНА

В БИОЛОГИЧЕСКО! ЖИДКОСТИ (57) Изобретение относится к иммуноИзобретение относится к иммунохимии и иммунологи ческому анализу и к иммунохимическому анализу гормонов.

Цель изобретения — увеличение чувствительности, ускорение и упрощение способа.

Способ определения тестостерона (ТС) осуществляется следующим образом, В лунках планшетов из полистирола сорбируют белок А из раствора,со- держащего 5 — 15 мкг/мл этого белка, в течение 16-20 ч при 4 С или не менее 2 ч при 37 С, после этого инкубируют в лунках сыворотку к ТС. После удаления избытка антител вносят смесь исследуемой пробы с конъюгатом

ТС и фермента пероксидазы (IM). Далее вносят хромогенный субстрат для ПХ и измеряют оптическую плотность продукта пероксидазной реакции, величина которой пропорциональна концентрации ТС. логическому анализу и представляет собой способ количественного определения тестостерона. Цель изобретения — увеличение чувствительности, ускорение и упрощение способа. Для этого полимерный носитель перед сорбцией антител обрабатывают белком А

S.aureus. до насыщения. Полученный иммуносорбент используют для твердофазного иммуноферментного анализа тестостерона. Чувствительность определения 8 пг/мл., Время анализа 2 ч

40 мин„.

Пример 1. Получение конъюгатов ТС с бычьим сывороточным альбумином (БСА) и с ПХ.

Предварительно готовят ТС-3-(окарбоксиметилоксим) (ТС-ЗСМО) следующим образом, К 250 мл ТС и 250 мг аминоуксусной кислоты добавляют 30 мл

207. (об/об) водного раствора метанола и ?О мл О,IМ водного раствора ацетата натрия. Суспензию размешивают при комнатной температуре в течение

1 ч. Затем добавляют еще 2,4 г. ацетата натрия до концентрации 1М и леремешивают суспензию при нагревании до 60 С 1 ч, Добавляют дважды по о

5 мл метанола при 60 С до получения прозрачного раствора и перемешивают 30 мин, Смесь оставляют при комнатной температуре на ночь, затем упаривают под вакуумом вдвое, Образовавшуюся суспенэию разбавляют водой до 100 мл, подщелачивают до рН

8-9 0,1н. гидроксидом калия до растворения осадка. Трижды экстрагируют

1497577

5i0 мл этилацетата. Экстракт упаривак1т досуха.

Конъюгат ТС-ЗСМО-БСА получают методом смешения ангидридов. 19 мг

ТС-ЗСMO растворяют в 2 мл диоксана,, 5

Добавляют 20 мкл трет-бутиламина и

10 мкл изо-бутилхлоркарбоната и пере ешивают в течение 1 ч при 12-15 С.

При помешивании добавляют к этому раствору раствор, содержащий 29 мг

А, 3 мл дистиллированной воды, 2 мкл 1н. гидроксида калия по капл м в течение 20 мин, перемешивают

3 ч при 0-4 С и диализируют против д сти)тлированной воды в течение ночи о при 12-15 С. Образовавшуюся смесь п1одщелачивают бикарбонатом натрия до рН 8-9, осадок отфильтровывают, доводят рН фильтрата до 3 концентри- 2О рованной соляной кислотой, образовавш яйся осадок отбрасывают, используют надосадочную жидкость. Молярное соотношение ТС вЂ” БСА в .конъюгате составляет 37:1. .25

Для получения конъюгата ТС-ПХ используют метод смешения ангидридов.

2 мг ТС-ЗСМО растворяют в 1 мп безводного диоксана, содержащего 2 мкл

3 н-бутиламина. При охлаждении до 30

5 9 С прибавляют 0,5 мл диоксана, содержащего 1 мкл изобутилхлоркарбонфта, и перемешивают при температур замерзания диоксана 1 ч 15 мин.

Этот раствор медленно добавляют порц ями по 50 мкл к охлажденному до

4 С раствору 10 мг ПХ в. 3 мл 0,5%-ногф раствора бикарбоната натрия.Послф перемешивания 2,5 ч при 4 С провОдят дважды диализ против 1 л 40

0 01н. калий фосфатного буфера,содержащего 0,1н, хлорид натрия, рН 7,2 (ФБ) в течение 2 ч и ночи при 4—

12 С. Молярное соотношение ТС-ПХ в конъюгате составляет 6:1.

Получение гетероиммунной антиТС-сыворотки.

Крольчих иммунизируют конъюгатом

T(-ЗСМΠ— БСА трижды (раз в 2 неделй) внутримьппечно по 1 мг (в смеси с полным адъювантом Фрейнда (1:1)) и трижды (раз в б недель) внутривенно по 0,8 мг на кролика (вес кролйков 2,5-3 Kr), Реиммуниэацию пров )дят через 9 месяцев путем двукратного внутривенного введения 0,8 мг

1 того же конъюгата, Кровь для получеЭ ноя сыворотки берут через 7-10 дней после последней иммунизации.

Получение иммуносорбента.

Иммуносорбентом служит гаммаглобулиновая фракция кроличьей гетероиммунной сыворотки к ТС, связанная с белком А, адсорбированным на планшете.

Иммуносорбент готовят сорбцией белка А стафилококка (5 мкг/мл белка А в ФБ) в лунках 96-луночных планшетов по 100 мкл на лунку в течение 18 ч при 4 С. Эта и все последующие операции ИФА сопровождаются промывкой планшетов дважды водопроводной водой и: дважды ФБ, содержащим

0,05% детергента тритон Х-100 или твин-20 (ТФБ).

Затем в лунки планшетов добавляют по 100 мкл анти-ТС-сыворотки в разведении 1:1000 в ТФБ, инкубируют в течение 2 ч при 37 С и отмывают

ТФБ.

Полученный иммуносорбент может о храниться до использования при 4 С в течение как минимум 4 мес (срок наблюдения), поэтому время его приготовления не лимитирует время анализа ТС.

Проведение ИФА.

Аликвоты плазмы человека.(0,1 мл) экстрагируют встряхиванием с 1 мл диэтилового эфира 10-15 мин, замораживают при (-1О) — (-20) С, эфирную фракцию сливают и упаривают досуха о нагреванием в водяной бане до 38-42 С.

Сухой остаток растворяют в 0,1 мл

ТФБ.

В каждую лунку планшета с иммуносорбентом вносят 100 мкл образца (экстракта плазмы крови) или стандарта (разведения ТС в ТФБ с концентрацией от 50 нг/мл до 4 пг/мл) для построения калибровочной кривой и

100 мкл раствора конъюгата ТС-ПХ в

ТФБ (концентрация 10 нг/мл по ПХ) и инкубируют 2 ч при 37 С.

По окончании инкубации добавляют субстратную смесь (0,04%-ный раствор о-фенилендиамина в.бидистиллированной воде, содержащей 0,008% перекиси водорода) по 100 мкл на лунку. Через

30 мин (температура комнатная) останавливают реакцию добавлением 100 мкл

2М серной кислоты и регистрируют оптическую плотность продукта ферментативной реакции при 490 нм.Пересчет оптической плотности продукта перексидазной реакции в концентрацию ТС проводят по калибровочному графику, 14975

77 6 щих активные центры ГьЪ-фрагментов антител связанных с белком А ч ::.ре =с

Fc-фрагменты и имеющих большую подвижность, чем при многоточечном контакте молекул с поверхностью косителя при прямой адсорбции. "àííûé подход удобен методически и позволяет избегать выделения иммуноглобулинов путем осаждения, что, как правило, приводит к потере части антител.

Время анализа 2 ч 40 мин. Чувствительность определения 8 пг/мл.

Составитель В,Митюшин

Техред Л. Олийнык

Корректор М.Максимишинец

Подписное

Редактор Л.Пчолинская

Заказ 4439/47

Тираж 789

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãoðoä, ул. Гагарина, 101 полученному при анализе стандартного препарата ТС.

Пример 2. Способ осуществляют согласно примеру 1 но концентраФ

5 ция белка А составляет 15 мкг/мл.

Чувствительность и продолжительность анализа та же, что и в примере 1.

Предложенный способ иммуноферментного определения ТС обладает высокой чувствительностью 8 пг/мл (0,26 х х 10 М), что в 8 раэ вьппе чувствительности, указанной в прототипе.

Общая продолжительность анализа составляет 2 ч 40 мин, что меньше времени проведения всех известных способов иммуноферментного определения

ТС, Положительным отличием предлагаемого способа является выделение гам- 20 маглобулинов из -сыворотки анти-TC непосредственно в лунках планшета с помощью аффинной адсорбции на белке А. Положительный эффект эа счет использования белка А предположи- 25 тельно обусловлен как пространственным разделением антител с носителем, так и энергетически выгодной для взаимодействия с ТС ориентацией несуФормула изобретения

Способ определения тестостерона в биологической жидкости путем обработки полимерного носителя антителами, инкубации исследуемой жидкости с конъюгатом тестостерона и фермента с последующим добавлением субстрата фермента и регистрацией содержания продукта ферментативной реакции по оптической плотности, о т— л и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения чувствительности,ускорения и упрощения способа, полимерный носитель предварительно обрабатывают белком А до насыщения,