Способ определения иммунопатологического состояния организма, связанного с нарушением в-клеточного звена иммунитета

 

Изобретение относится к области медицины , в частности к иммунологии. Целью изобретения является повышение точности диагностики иммунопатологических состояний , характерных для аутоиммунных и лимфопролиферативных заболеваний Для достижения цели мононуклеэры периферической крови перед культивированием обрабатывают митомицином С и определяют уровень спонтанной секреции иммуноглобулинов по отношению к контролю При величине остаточного синтеза иммуноглобулинов более 7% судят о наличии иммунопатологического процесса Способ эффективен в 74% случаев и позволяет повысить точность диагностики в среднем на 14% (/ С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (5П5 G 01 N 33/53

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4462293/14 (22) 18,07,88 (46) 23.10.91. Бюл. М 39 (71) Институт клинической иммунологии Сибирского отделения АМН СССР (72) А.А. Останин, Е.Р, Черных, В.И. Некипелова и Г.З. Шубинский (53) 615.375 (088.8) (56) Tanaka 1., Shirakawa F„Ota Т. et, аl.

Mechanism of spontaneous activation of В:

cells in patients with systemic lupus

erythematosus. Analysis with auti-class 11 aut

body. — I. immunology, 1988, 140, М 3, р.

761 — 767, Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть испол ьэова но в сложн ых диагностических случаях, а также в случаях подозрения на иммунопатологию, характерную для аутоиммунных и лимфопролиферативных заболеваний.

Целью изобретения является повышение точности диагностики.

Способ осуществляют следующим образом, Иэ периферической крови обследуемых пациентов выделяют мононуклеары (MK) центрифугированием гепаринизированной венозной крови (100 ЕД гепарина на 1 мл крови) в градиенте плотности фиколла-ве...!Ж„„1686365 Al (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИММУНОПАТОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ ОРГАНИЗМА, СВЯЗАННОГО С НАРУШЕНИЕМ

В-КЛЕТОЧНОГО ЗВЕНА ИММУНИТЕТА (57) Изобретение относится к области медицины, в частности к иммунологии. Целью изобретения является повышение точности диагностики иммунопатологических состояний, характерных для аутоиммунных и лимфопролиферативных заболеваний. Для достижения цели мононуклеары периферической крови перед культивированием обрабатывают митомицином С и определяют уровень спонтанной секреции иммуноглобулинов по отношению к контролю. При величине остаточного синтеза иммуноглобулинов более 7% судят о наличии иммунопатологического процесса. Способ эффективен в 74% случаев и позволяет повысить точность диагностики е среднем íà 14%. рографина(плотность 1,077) при 800 g. 5х10 О©

MK в среде 199, дополненной 10%-ной фе- СЬ тальной телячьей сыворотки (ФТС), обраба- () тывают митС (Sigma) в дозе 40 мкг/мл в ( течение 45 мин при 37 С. Затем клетки тро- (у) екратно отмывают в среде 199 и ресуспендируют в среде культуральной RPMI- 1640, дополненной 0,3 мгlмл l-глютамина, 2 мМ

Hepes-буфера, 100 мгк/мл гентамицина и

10% ФТС. Необработанные и обработанные митС МК (0,2х10 /лунку) культивируют

- 6 в круглодонных лунках планшетов лая иммунологических исследований при 37 С в

С 02-инкубаторе. Интенсивность секреции иммуноглобулинов (ИГ) определяют на 7-е сутки методом иммуноферментного анали1686365 киси водорода. После инкубации в течение

10 — 15 мин при комнатной температуре цветовую реакцию останавливают добавлени- 45

50 л l00% эа(ИФА), Для этого 96-луночные плоскодонные планшеты (Flow) обрабатывают раствором бараньих антител против L-цепей ИГ человека (10 мкгlмл) в 0,01 М карбонатном буфере (рН 8,6-9,0) в обьеме 0,1 мл/лунку в течение 4 — 5 ч при 37 С во влажной атмосфере. Далее планшеты троекратно отмывают фосфат забуференным физиологическим раствором (ЗФР, рН 7,2). Для предотвращения неспецифического связывания планшеты обрабатывают 1о/(,-ным раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА, Sigma) в 0,01 M карбонатном буфере в объеме 0,15 мл/лунку в течение 16-18 ч при 4 С во влажной камере, После этого планшеты троекратно отмывагот раствором 0,05 %ного твина (Tween 20, Ferak). Исследуемые культуральные супернатанты разводят 1;4 в

ЗФР, содержащем 0,05% таина, перед внесением в лунки планшет для иммуноферментного анализа. Одновременно готовят калибровочные разведения эталонной сыворотки человека (от 1600 до 12 нг/мл) в аналогичном растворе, Супернатанты и эталонную сыворотку вносят в объеме 0,1 мл/лунку и инкубируют 1 — 2 ч при 37 С, Планшеты отмывают 5 раз 0,05%-ным раствором твина, Далее в лунки вносят конъюгированные с пероксидазой хрена антитела против L-цепей ИГ человека (0,1 мл/лунку) в разведении 1;750. Инкубацию проводят при

37 С в течение 1 — 2 ч, после чего планшеты отмывают 10 раз 0,05оь-HblM раствором твина. Ферментативную активность пероксидазы в образовавшихся комплексах определяют добавлением в лунки по 0,1 мл субстратного раствора, приготовленного следующим образом: 1,2-фенилдиамин (10 мг на 1 мл метипового спирта) разводят в

0,05.М цитратном буфере (рН 4,6) в соотношении 1:99 и к 100 мл указанной смеси добавляют 0,01 мл 33%-ного раствора переем в лунки по 0,05 мл 50%-ной серной кислоты. Фотометрию проводят на аппарате Мультискан (Нов) при длине волны 472 нм. Концентрацию ИГ (нгlмл) определяют, откладывая среднее. значение оптической плотности из трех идентичных образцов на прямом отрезке калибровочной кривой, О наличии иммунопатологического состояния судят по величине остаточного ИГсинтеза. рассчитанной по формуле

ИГ-синтез (нг/мл) в культурах митс- обработанных МК

ИГ-синтез(нгlмл) в культурах МК, необработанных митс

При величине более 7% судят о наличии активированных В-лимфоцитов, характерных для иммунопатологического процесса.

Пример 1. Больной Г., 27 лет, поступил в нефрологическое отделение, При поступлении жалоб не предьявлял. Иэ анамнеза в июле 1987 г. больной перенес глубокий термический ожог левого предплечья с последующей кожной пластикой, В августе 1987 г. впервые отметил рецидивирующие макрогематурии, появление которых связывает с переохлаждением.

Направлен на обследование.

При обьективном исследовании патологических изменений со стороны внутренних органов не отмечено. В общем анализе крови регистрировалось умеренное увеличение

СОЭ: Эр 4,27 х; Гем 147 г/л; Лейк 6,6 х 109/л; СОЭ 16 мм/ч. Мочевина крови 4,66 ммоль/л; СРБ 0; холестерин 4,68 ммоль/л;

Р-липопротеиды 4700 мг/л; белок крови 68,3 г/л, Белковые фракции; альбумины 62%; глобулины — а) 4;4, а2 5% j3 11%,у 18%, Креатинин крови 0,105 ммоль/л, клубочковая фильтрация 127 мл/мин, реабсорбция

99,0%, Количественное определение форменных элементов в моче пробой Нечипоренко: Лейк 1000/мл; Эр О; цилиндры О; суточная протеинурия — следы. Ультразвуковое исследование почек (эхография), цистоскопия патологических изменений не выявили.

Проведенные клиника-лабораторные исследования (лишь умеренное увеличение

СОЭ) не позволяли судить о течении какоголибо иммунопатологического процесса в почках, Складывалось впечатление о наличии в анамнезе транзиторной гематурии, обусловленной алиментарными факторами.

Однако, иммунологическое исследование по предлагаемому способу выя вило, что уро,вень спонтанной ИГ-секреции в культуре

МК, необработанных митС, составил 4700 нг/мл, а в культуре МК, обработанных митС, -500 нг/мл, Уровень остаточного ИГ-синтеза равен 10,6%. Следовательно, среди лимфоцитов периферической крови пациента присутствуют активированные В-клетки, способные секретировать ИГ без пролиферации, что является характерным признаком иммунопатологического состояния, При проведенном впоследствии гистологическом исследовании почечного биоптата был установлен диагноз хронического, мезангиопролиферативного гломерулонефрита, Окончательный клинический диагноз: хронический гломерулонефрит, гематурическая форма,мезангиопролиферативный вариант.

1686365

Пример 2. В онкологический диспансер была направлена на консультацию амбулаторная больная Л., 33 года, с диагнозом: лимфоаденопатия неясного генезэ.

Больная предъявляла жалобы на повышенную утомляемость и на увеличение шейных лимфоузлов. Две недели назад(начало сентября 1987 "",.) почувствовала недомогание: сухой кашель, подъем температуры до

37,4 С, потливость. Участковым терапевтом был поставлен диагноз: острое респираторное заболевание и назначена адекватная терапия. Через 7 дней симптомы воспаления были купированы, однако сохранялась общая слабость и повышенная утомляемость. Объективно выявлялись увеличенные(1,5 — 2,0 см), плотные, безболезненные, подвижные лимфоузлы. В общем анализе крови: Эр 4,6х10 /л; Гем 146 г/л; Лейк

6,8х10 /л; СОЭ 12 мм/ч. Других патологических симптомов не обнаружено. Для уточнения диагноза больная была направлена на консультацию в онкодиспэнсер.

Из данных объективного и лабораторного обследований четкого представления о характере заболевания не складывалось.

Увеличение лимфоуэлов могло отражать реакцию организма на предшествующее воспаление (ОРЗ), могло быть проявлением лимфолейкоза (но нормальный общий анализ крови исключал данное предположение) и, наконец, увеличение лимфоузлов могло быть в результате матастазирования какойлибо злокачественной опухоли. Дифференциальная диагностика вызывала затруднения.

Проведенное иммунологическое обследование по предлагаемому способу показало, что уровень спонтанной секреции ИГ в культурах интактных MK составил 1100 нг/мл, а после обработки из митС 425 нгlмл. Таким образом, уровень остаточной ИГ-секреции равен 38,6 . Следовательно, среди лимфоцитов периферической крови больной Л. присутствуют активированные В-клетки, способные секретировать ИГ без пролиферации, что свидетельствует о наличии иммунопатологического состояния, вероятнее всего, лимфопролиферативного генеза.

Проведенная впоследствии биопсия лимфоузла подтвердила данное предположение.

Окончательный диагноз: лимфосаркома лимфатических узлов, нодулярная форма.

5 Пример 3. Больному0.,26лет, после прохождения профилактического осмотра в поликлинике был выставлен диагноз; хронический тонзиллит, компенсированная форма, гипертрофия миндалин И степени и для

10 исключения различных осложнений (в том числе аутоиммунных) было рекомендовано расширенное лабораторное обследование, Иммунологическое исследование по предлагаемому способу показало, что уровень

15 спонтанной секреции ИГ в культурах интактных МК составил 2520 нг/мл, а в культуре митС-обработанных MK — 45 нг/мл, Уровень остаточного ИГ-синтеза равен 1,8 . Таким образом, при неспецифических воспалитель20 ных заболеваниях среди циркулирующих лимфоцитов отсутствуют активированные Вклетки, способные секретировать ИГ без пролиферации, и у данного пациента нет иммунопатологии, ассоциированной с ауто25 иммунными или лимфопролиферативными заболеваниями, Способ позволяет выявить наличие иммунопатологического состояния при отсутствии достаiî÷í ых клинико-лабораторных данных

30 и позволяет повысить точность диагностики в среднем на 14, Формула изобретения

Способ определения иммунопатологи35 ческого состояния организма, связанного с нарушением В-клеточного звена иммунитета, путем оценки уровня спонтанной секреции иммуноглобулинов в культуре интактных мононуклеаров периферической

40 крови, отличающийся тем,что,сцелью повышения точности способа, перед культивированием пробу с мононуклеарами обрабатывают митомицином С и при уровне остаточной секреции иммуноглобупинов более 7 no

45 сравнению с пробой без митомицина определяют наличие иммунопатологического состояния.

1686365

Составитель Р,Гуменюк

Техред M,Ìîðãåíòàë Корректор M.Êó÷åðÿaàÿ

Редактор И.Дербак

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, yn,Гагарина, 101

Заказ 3595 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5