Способ определения содержания фибронектина в биологических жидкостях

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (si>s G 01 N 33/53

ГОСУДАРС1 ВЕННЫЙ КОМИТЕТ

Г10 ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ (", " .;,:;:::„":.,""

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4642708/14 (22) 27.01.89 (46) 23,10.91. Бюл. М 39 (71) Кемеровский государственный медицинский институт (72) И.Н. Овчарук, Н.А. Федоров и В.А. Котиков (53) 615.475 (088.8) (56) Y. Lab. СИп. Med.,1985,106,4, р. 173 — 180. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ФИБРОНЕКТИНА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ (57) Изобретение относится к области медицины, преимущественно к гематологии и трансфузиологии, хирургии, терапии, инфекционным заболеваниям, и может быть использовано для определения количества функционально активного фибронектина в

Изобретение относится к области медицины, преимущественно к гематологии и трансфузиологии. хирургии, терапии, инфекционным заболеваниям и может быть использовано для определения количества функционально активного фибронектина в биологических жидкостях.

Целью изобретения является повышение специфичности и чувствительности за счет определения содержания функционально активного фибронектина.

Пример 1. В качестве биоспецифического сорбента используются формалиниэированные эритроциты барана тип 2 (Уфимского НИИ вакцин и сывороток им.

И.И. Мечникова). Их отмывают от консерванта 0,2 М фосфатным буфером рН 7.2-7,3, „„ ду „„1б8637ОА1 биологических жидкостях. Цель изобретения — повышение специфичности и чувствительности спссоба определения содержания функционально активного фибронектина. Положительный эффект достигается определенной последовательностью приемов обработки поверхности формалиниэированных эритроцитов барана при следующих соотношениях компонентов: 1 объем 100 -ных формалинизированных эритроцитов барана.

1 обьем 10%-ного медицинского желатина: 1 объем 25 -ного глютарового альдегида и 9 объемов фосфатного буфера. Количественное определение функционально активного фибронектина основано на торможении реакции гемагглютинации желатином, содержащимся в инкубационной среде, с последующим вычислением концентрации фибронектина по предлагаемой формуле. инкубируют в 0.5 М трис-HCl буфере рН

7,4 — 7,6, содержащим 10 мМ CaClz и 0,01 g трипсина, при 37 С в течение 30 мин. Трипсин и продукты гидролиза удаляют 3 — 4хкратной промывкой 0,05 M трис-HCl буфером рН 7,4-7,6 и затем промывают 6д

0,9%-ным раствором хлористого натрия. 4

В центрифужную пробирку вносят 900 О мкл фосфатного буфера рН 7,2 — 7,3, 100 мкл, обработанных трипсином эритроцитов барана, 100 мкл 10%-ного медицинского желатина и 100 мкл 25 -ного раствора глутарового альдегида, Перемешивают и инкубируют 30 мин при 37 С. Полученный диагностикум промывают 3 — 4 раза фосфатным буфером рН 7,2 — 7,3 и к осадку эритроцитов добавляют 3 мл 1 -ного раствора

1686370 бычьего сывороточного альбумина в щ

NaCI.

Постановку РТПГД выполняли следующим образом.

Ц начале исследования устанавливают количественное соотношение желатина и фибронектина, при котором наступает торможение реакции гемагглютинации, Для этой цели используют планшеты для иммунологических исследований отечественного производства. Неспецифическая сорбция и спонтанная гемагглютинация эритроцитов устраняется проведением реакции, в растворе 1 -ного бычьего сывороточного апьбумина, приготовлзнного на IM растворе хлорида натрия. Данный раствор эльбумина используется для разведения желатина. С этой целью в восемь пробирок вносят по 1 мл раствора альбумлна. Затем в первую пробирку приливают 1 мл 0,1",4-ного раствора желатина, перемешива от и 1 мл из первой пробирки переносят В0 вторую, перемешивают и 1 мл из второй пробирки переносят в третью и т.д, Таким образом, получают следующие концентрации желатина: 0,05%, 0,025, 0,0125%, 0,00625%, 0,003125%, 0,0015625, 0,00078125, 0,00039, В каждую ячейку планшета первого ряда слева направо вносят по 50 мкл 0,05 -ного раствора желатина; во второй ряд ячеек — 0,025 раствора желатина; в третий — 0,0125 -ный раствор желатина и т.д. Затем в первую ячейку первого ряда добавляют 50 мкл раствора фибронектина с известной концентрацией (например — 625 мкг/Mll) и после перемешивания 50 мкл из первой ячейки переносят во вторую и т.д. Из 11 ячейки 50 мкл выбрасывают. 12 ячейка служит контролем и йе содержит фибронектина. Аналогичным образом готовят ряд разведений фибронектина в остальных восьми рядах ячеек. Таким образом, концентрация желатина уменьшается в ряду сверху вниз, а содержание фибронектина снижается в каждом ряду слева направо. В каждую ячейку, начиная с контрольной, т.е. справа налево, вносят по 25 мкл 1 -ной взвеси эритроцитов барана (диагностикум). Тщательно перемешивают и оставляют на 2-3 часа при комнатной температуре. Образование кольца в виде венчика указывает на гемагглютинацию, а выпадение эритроцитов на дно ячейки в виде точки свидетельствует об отсутствии гемагглютинэции. В каждом ряду находят ячейку. где реакция гемагглютинации отрицательная и на основании данных концентраций желатина и

5l» фибронектина вычисляют отношение желатин/фибронектин. Оно характеризует то минимальное соотношение концентраций желатина и фибронектина, при котором наступает полное торможение реакции гемагглютинации, Согласно полученным данным это соотношение равно 6,4 и зависит только от чистоты и источника желатина, Для определения содержания фибронектина в исследуемой жидкости выбирают, в зависимости от предполагаемого его количества, раствор желатина (например, 0,0125 -ный раствор) и вносят его по 50 мкл во все ячейки планшета. Затем в ячейку первого ряда добавляют 50 мкл исследуемой жидкости, перемешивают и методом переката слева направо отовят ряд разведений, 50 мкл из 11 ячейки выбрасывают; 12 ячейка служит контролем и содержит только раствор желатина. Во втором ряду ячеек готовят аналогичным образом разведение нового образца исследуемой жидкости, Таким образом, на одном планшете для иммунологических исследований проводят определение количества фибронектина в восьми образцах проб. Далее, начиная с контрольных ячеек, вносят по 25 мкл 1 ной взвеси диагностикума, перемешивают и оставляют при комнатной температуре до завершения реакции торможения гемагглютинации (40-60 минут). Затем в каждом ряду находят ячейку начала торможения реакции гемагглютинации. Содержание фибронектина определяют по следующей формуле: содержание фибронектина = количество желатина

6,4 где в знаменателе — полученный коэффициент соотношения желатин/фибронектин — 6,4; в числителе — количество желатина в ячейках ряда;

А — разведение исследуемой пробы в ячейке начала торможение гемагглютинации;

20 — коэффициент перевода данных на

1 мл исследуемой пробы.

При сравнительном определении содержания фибронектина в 5 образцах плазмы крови человека методом реакции торможения пассивной гемагглютинации и реакцией агрегации частиц латекса получены следующие результаты:

1686370

Реакция агрегации частиц латекса

Реакция торможения пассивно ии

Количество опытов

351+59 мкгlмл

286+5,3 мкг/м/л

Составитель П,Бонарцев

Тех ред M.Моргентал Корректор М.Кучерявая

Редактор Л.Лашкова

Заказ 3595 Тираж

ВНИИПИ Гос а ствен

Подписное

1 осударственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ. СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент" . У, .Г, r. жгород, ул.Гагарина, 101

Преимуществами предлагаемого способа определения содержания функционально активного фибронектина в биологических жидкостях по сравнению с прототипом являются:

Высокая (в 10 раэ) чувствительность, что 5 позволяет определять содержание фибронектина в спинномоэговой и амниотической жидкостях, где его концентрация находится в пределах 50 мкг/мл, Введение в систему желатина исключает возможность неспеци- 10 фической агглютинации. Способ позволяет одновременно вести в идентичных условиях определение содержания фибронектина в

8 — 12 пробах, он менее трудоемок и не требует специальной аппаратуры. 15

Формула изобретения

Способ определения содержания фибронектина в биологических жидкостях путем внесения в исследуемую пробу 20 сенсибилиэированных желатином корпускулярных частиц сорбента с последующим определением количества фибронектина по титрам реакции агрегации частиц, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью повышения специфичности и чувствительности эа счет определения содержания функционально активного фибронектина, в качестве частиц сорбента используют формалиниэированные эритроциты барана, при этом их сенсибилизируют путем предварительной трипсиниэации и промывки с последующей инкубацией с желатином в присутствии глутарового альдегида в течение 30 мин при

37 С, далее реакцию ведут в среде, содержащей 1 объем 100 -ных формалиниэированных эритроцитов барана, 1 объем

10 -ного медицинского желатина, 1 объем

25 -ного глутарового альдегида и 9 объемов фосфатного буфера, а количество функционально активного фибронектина определяют по титрам реакции торможения гемагглютинации.