Способ определения активности рецепторов нейтрофилов человека

 

Изобретение относится к медицине, преимущественно к иммунологии, и может быть использовано для оценки функциональной активности Fc-рецепторов и СЗв рецепторов нейтрофилов человека. Целью изобретения является упрощение и ускорение определения. Способ включает подготовку частиц-носителей, связанных с IgG, либо СЗв-фактором комплемента, стимуляцию этими частицами нейтрофилов, находящихся в составе разведенной крови, в соотношении 1:50-1-: 150 и оценку функциональной активности Fc-рецепторов и СЗврецепторов нейтрофилов по интенсивности люминолзависимой хемилюминесценции. Способ позволяет в несколько раз уменьшить объем исследуемой крови, исключить сложные предварительные процедуры обработки крови, сократить в 2-2,5 раза время определения.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 6 01 N 33/543

ГОСУДАРCTВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCKOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4406390/14 (22) 06.04.88 (46) 23,10.91, Бюл. ¹ 39 (71) Нижегородский государственный медицинский институт им. С.М, Кирова (72) А.Н. Маянский, И.В. Чеботарь, Ю.В, Лебедева, A.Ë. Невмятуллин, Н.И. Сибирякова и Т,M. Конышкина (53) 615.375. (088.8) (56) Aust. I, Ехр. Hioi. Mech. Sci., 1984, v. 62, р, 403 — 419. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ РЕЦЕПТОРОВ НЕЙТРОФИЛОВ ЧЕЛОВЕ КА (57) Изобретение относится к медицине, преимущественно к иммунологии, и может быть использовано для оценки функциоИзобретение относится к области медицины, преимущественно к иммунологии, и может быть использовано в качестве дополнительного теста при оценке эффекторных свойств нейтрофилов.

Целью изобретения является упрощение и ускорение определения.

В качестве носителя IgG используют убитые бактериальные клетки Staphylococcus

aureus, штамм 141*, либо пептидогликан

Staphylococcus aureus, штамм 885.

Суточную культуру Staphylococcus

aureus, штамм 141, выращенную на мясопептонном агаре, трижды отмывают стерильным физиологическим раствором. прогревает 30 мин при +80 С, доводят концентрацию до 20 млрд. бакт. клеток/мл и хранят при +40С (срок хранения до 12 мес.).!

Ж 1686372 А1 нальной активности F<-рецепторов и СЗв-. рецепторов нейтрофилов человека. Целью изобретения является упрощение и ускорение определения. Способ включает подготовку частиц-носителей. связанных с IgG. либо С3е-фактором комплемента, стимуляцию этими частицами нейтрофилов, находящихся в составе разведенной крови, в соотношении 1:50-1 —:150 и оценку функциональной активности Fc-рецепторов и СЗврецепторов нейтрофилов по интенсивности люминолзэвисимой хемилюминесценции, Способ позволяет в несколько раз уменьшить объем исследуемой крови, исключить сложные предварительные процедуры обработки крови, сократить в 2-2,5 раза время определения.

Пептидогликан получают из клеточных стенок Staphytoccucus aureus, штамм 885 по О" методу Peterson et ai,(Peterson Р.F., Wilkinson В,I„KIm Y, et al. "The Key cole of Ch

peptIdogIycan! и the opsonisatIon of S. (iд

aureus. — 1.ClIn,Twest. — 1978..— № 61. — р.

597-609). Суточную культуру бактерий, вы- (с ращенную на мясопептинном агарв, трижды отмывают дистиллированной водой, взвешивают в физиологическом растворе в концентрации 200 млрд бакт. клеток/мл и разрушают в гомогенизаторе Л-17 К 33 МИ стеклянными бусами диаметром 0,7 мм (20 мин при 0 С, 1000 оборотов/мин).После трехкратного отмывания дистиллированной водой и удаления неразрушенных клеток (дифференциальное центрифугирование при 4000 g в течение 10 мин) клеточные

1686372 стенки ресуспендируют в 100 мл 2 4-ного раствора додецилсульфата натрия ("Serva", Сш А) и инкубируют 18 ч и ри комнатной температуре. Осадок етырехкратно отмывают при 8000 g в течение 15 мин, взвешивают в

100 мл 0,05 M трис-HCI-буфера (pH 7,4). содержащего 0,005 М М9С!2, добавляют 20 мкгlмл PHK-аэы ("НеапаГ, ВН Р), 20 мкг/мл

ДНК-аэы ("Реахим", СCCP). инкубируют 60 мин при +37 С, затем вносят 200 мкг/мл трипсина ("Spopha", ЧСФР) и продол>кают инкубацию еще 4 ч при 37 С, Клеточные стенки отмывают трижды при 8000 g no 15 мин. Осадок ресуспендируют в 5 мл дистиллированной воды, добавляют равный объем

80 Р-ного раствора фенола и инкубируют 30 мин при комнатной температуре, После трехкратного отмывания (8000 g, 15 мин) осадок ресуспендируют в 5 мл дистиллированной воды, вносят 5 мл 20 Р-ного раствора трихлоруксусной кислоты и ь нкубируют

90 мин при+60 С. Затем пептидогликан отмывают дистиллированной водой до pH 6,0 и взвешивают в растворе Хенкса до концентрации 100 мгк/мл.

Фракцию lgG выделяют из коммерческого иммуноглобулина путем хроматографии на ДЭАЗ-тоя поле ("Toyo Soda", Я ион ия) при помощи элюции 0,01 M фосфатным буфером, рН 6,5. Опсснизацию объектов-носителей (конечная концентрация стафилококка — 5 млрд. бактерий/мл, пептидогликана — 10 мгк/мл) иммуноглобулинами

6 (конечная концентрация IQG 10 мг/Mll) проводят при+ 37" С в течение 30 мин, трижды отмывают физиологическим раствором и взвешивают в растворе Хенкса: стафилококки до концентрации I млрд/мл, пептидогликан — - 10 мкг/мл. Препараты хранят при

+4 С (срок хранения 3 мес), В качестве объекта-носителя СЗв-фракции комплемента используют зимозан ("Реахим", г. Олайне). Зимозан, связанный с

СЗв-фактором комплемента, получают по ме одике Stossei et а1. (Stossel Т,Р., Field

ИЛ., Gitlin l,o, е al, " The opsonic fragment of

the thIråI component of human complement (СЗ), — I. Ехр. Med, -- 1975, ч, 141. р. 13291347), Зимоэан взвешивают в физиологическом растворе рН 7,2-7,4 в концентрации 10 мгlмл, прогревают при 100 С в течение 15 мии. После трехкратного отмывания физиологическим раст вором (центрифугирование п,.и 10009 в течение 15 мин) эимоэан опсониэируют пулом сывороток 40 доноров при

+37 С в течение 30 мин, трижды отмывают физиологическим раствором (центрифугирояаиие при 1000g в течение 15 мин), взвешивайг в 2 M растворе NaCI и инкубируют

55 при +100 С в течение 10 мин; после трехкратного отмывания препарат доводят раствором Хенкса до концентрации 10 мг/мл, Хранят при +4 С. В качестве контроля используют зимозан, обрабатанный пулом сывороток по указанной методике в присутствии 0,01М зтилендиаминтетраацетата, т.е, в условиях, исключающих активацию комплемента и связывание СЗв-фактора с зима заном.

Периферическую кровь забирают путем укола иглой-скарификатором в мякоть дистальной фаланги Ill пальца левой руки в стерильных условиях. Микропипеткой, обработанной гепарином, забирают 0,12 мл крови и разводят ее в 12 мл раствора Хенкса, содержащего 0,1% желатины, Таким образом получают разведение крови 1:100, Для полного исключения влияния опсонических факторов плазмы при оценке функциональной активности Fc — рецепторов нейтрофилов форменные элементы отделяют от плазмы и ресуспендируют в растворе

Хенкса. Для этого полученную вышеуказанным способом кровь разводят раствором

Хенкса в соотношении 1:50 — 1:150 центрифугируют 4 мин при 400g, удаляют надосадочную жидкость и разводят 100-кратным объемом раствора Хенкса, содержащего

О, l желатины. Все манипуляции с кровью производят в дважды силиконированной стеклянной посуде, Интенсивность люминолэависимой хемилюминесценции регистрируют на жидкостно-сцинтилляционной счетчика "Бета-1" (ПО "Медаппаратура", Киев) в течение 30 мин при +37 С. К 1 мл разведенной крови либо форменных элементов, взвешенных в растворе Хенкса, добавляют 0,1 мп 10 "M раствора люминала ("Реахим", Ереван), инкубируют 15 мин при +37 С для стабилизации спонтанной хемилюминесценции.

Стимуляцию проводят объектами, связанными с IgG либо с СЗв-фактором комплемента. Использование в качестве носителя

IgG микробных клеток золотистого стафилококка, штамм 141, значительно упрощает получение объекта-носителя. Однако, стафилококки, как и любые другие микроорганизмы, относительно неоднородны даже внутри штамма и подвержены изменчивости, В качестве более стандартного носителя IgG можно использовать пептидогликан золотистого стафилококка, штамм 885. Пептидогликан данного штамма имеет хорошо изученную химическую и антигенную структуру и является более стандартным объектом для использования в реакциях с нейтрофилами, но процесс получения пептидогликана более трудоемок и длителен.

1686372

К реакционной взвеси (1 мл разведенной крови с 0,1 мл 10 М раствора люмино ла или 1 мл форменных элементов, взвешенных в растворе Хенкса, с 0,1 мл

10 M раствора люминола) добавляют по

0,1 мл взвеси объектов, связанных с lgG или

СЗв-фактором (концентрация IQG-опсонизированного стафилококка и пептидогликана— соответственно 500 млн. бакт.клеток/мл и 10 мкг/мл, зимоэана — 10 мг/мл), В качестве контроля используют объекты, не обработанные igG либо СЗв-фактором комплемента (в соответствующих дозировках). Каждую пробу исследуют в трех повторениях. Хемилюминесценцию измеряют при красном свете. При оценке функциональной активности Fc-рецепторов хемилюминесценцию измеряют через 30 мин после внесения стимулятора, при оценке СЗв-рецепторов — через 10 мин после внесения стимулятора. Результаты учитывают по разнице между максимальными показателями хемилюминесценции, индуцированной объектами, связанными с IgG или СЗв, и уровнем хемилюминесценции при стимуляции объектами, необработанными IgG и СЗв, на тех же сроках.

Необходимо оценить функциональную активность Fc-рецепторов и СЗв-рецепторов нейтрофилов периферической крови.

Пример 1. (Выписка иэ протокола М

102 от 30 марта 1987 года, донор крови—

Чекуров А.А., 19 лет). Порядок исследования: в качестве носителя IgG использовали бактериальные клетки золотистого стафилококка, штамм 141. Для этого взвесь убитых прогреванием бактериальных клеток (концентрация — 5 млрд/мл) опсонизировали йри 37 С раствором иммуноглобулина G (конечная концентрация — 10 мг/мл) (30 мин) трижды отмывали физиологическим раствором и ресуспендировали в растворе Хенкса в концентрации 500 млн. микробных тел/мл. Суспенэию зимоэана опсонизировали пулом сывороток крови человека при

+37 С в течение 30 мин, трижды отмывали физиологическим раствором и ресуспендировали в растворе Хенкса в концентрации

10 мг/мл. 0,12 мл гепаринизированной крови, полученной уколом из пальца, разводили раствором Хенкса, содержащим 0,1 желатины, в соотношении 1:100, В стандартные стинциляционные флаконы вносили по

1 мл разведенной крови и 0.1 мл 10 М раствора люминола, инкубировали 15 мин при

+37 С. Для оценки Fc-рецепторов к реакционной смеси добавляли 0,1 мл взвеси Ig G-опсониэированного золотистого стафилококка (концентрация 500 млн. бактер.клеток/мл) и измеряли хемилюминесценцию через 30 мин, Для оценки СЗв-рецепторов нейтрофилов к

55 реакционной смеси добавляли 0,1 мл взвеси

СЗв-опсонизированного зимозана (концентрация 210 мг/мл) и измеряли хемилюминесценцию через 10 мин. B качестве контроля использовали необработанные стафилококки и зимозан в соответствующих дозировках. Каждую пробу делали в трех повторениях.

Результаты: при стимуляции IgG-опсонизированными бактериями (стафилококками) хемилюминесценция составила в среднем (по результатам трех проб) 434865 имп/мин, при стимуляции неопсонизированным стафилококком — 244 415 имп/мин.

При стимуляции СЗв-опсонизированным зимозаном хемилюминесценция составила

1,200 610 импlмин, при стимуляции неопсонизированным зимозаном — 265 435 имп/мин. Заключение: Fc-рецепторы и СЗврецепторы нейтрофилов исследуемой крови функционально активны, так как стимуляция через эти рецепторы вызывает значительное усиление хемилюминесценции, Пример 2. (Выписка из протокола М

104 от 11 апреля 1987 года, донор — Конышкина T.M.). Порядок исследования — тот же.

Результаты: при стимуляции lgG-опсонизированными стафилококками хемилюминесценция составила 475 562 имп/мин, при стимуляции неопсониэированными стафилококками — 221 540 имп/мин. При стимуляции СЗв-опсонизированным эимоэаном хемилюминесценция составила 1 544 655 имп/мин, неопсонизированным зимозаном — 187 767 имп/мин. Заключение: Fc-рецепторы и СЗв-рецепторы нейтрофилов исследуемой крови функционально активны, так как стимуляция через эти рецепторы вызывает значительное усиление хемилюминесценции.

Пример 3. (Выписка из протокола М

118 от 21.10.87 года, донор — больной Сергеев А.А.). Порядок исследования — тот же, Результаты: при стимуляции IgG-опсонизированными стафилококками хемилюминесценция составляла 273 506 имп/мин, при стимуляции неопсонизированными стафилококками — 272 387 имп/мин. При стимуляции СЗв-опсонизированным зимозаном уровень хемилюминесценции составлял 227

981 имп/мин, при стимуляции неопсонизированным эимозаном — 224 749 имп/мин.

Заключение; Fc-рецепторы и СЗв-рецепторы нейтрофилов исследуемой крови являются функционально неактивными, так как не наблюдается значительной разницы между показателями хемилюминесценции, инициированной IgG-опсонизированными и неопсонизированными объектами.

1686372

Составитель П.Бонарцев

Редактор Л.Лошкарева Техред М.Моргентал Корректор М, Шароши

Заказ 3595 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород. yn,ÃàãàðèHà, 101

Необходимо оценить функциональную активность Fc-рецепторов нейтрофилов.

Пример 4. (Выписка из протокола М

106 от 14.04.87 года, донор — Чеботарь И. B,).

Порядок исследования; в качестве носителя

IgG использовали пептидогликан золотистого стафилококка, штамм 885, Пептидог-. ликан (конечная концентрация 10 мгк/мл) опсонизировали раствором иммуноглобулина G конечная концентрация 10 мг/мл) при +37 С в течение 30 мин, трижды отмывали физиологическим раствором и ресуспендировали в растворе Хенкса в концентрации 10 г/мл. Порядок подготовки крови для измерения хемилюминесценции тот же (см. пример 1), К реакционной смеси добавляли по 0,1 мл взвеси IgG-обработанного пептидогликана (концентрация 10 мкг/мл) и измеряли хемилюминесценцию через 30 мин, В качестве контроля использовали пептидогликан, не обработанный

IgG. Результаты; при стимуляции IgG-обработанным пептидогликаном хемилюминесценция составляла 1 263 331 имп/мин, при стимуляции необработанным пептидогликаном — 234 220 имп/мин. Заключение: Fcрецепторы нейтрафилов исследуемой крови функционально активны, так как наблюдается значительная разница между показателями хемилюминесценции при стимуляции

IgG-опсониэированным и неопсонизированным пептидогликаном.

Пример 5, (Выписка иэ протокола М

116 от 19 июня 1987 года, донор крови—

Невмятуллин А,Л„30лвт). Порядок исследования: 0,12 мл гепаринизированной крови, полученной уколом иэ пальца, разводили раствором Хенкса в соотношении 1:50, при помощи центрифугирования отделяли форменные элементы крови от плазмы и ресуспендировал и форменные элементы в

100-кратном объеме (от исходного объема крови) раствора Хенксв, содержащего 0,1 ь желатины. Порядок подготовки полученных форменных элементов для измерения хемилюминесценции аналогичен описанномувыше (см. пример 1), В качестве объекта-Носителя IgG использовали убитые прогреванием бактериальные клетки золотистого

5 стафилококка (штамм 141). Порядок стимуляции и измерения хемилюминесценции описан в примере 1, Результаты: при стимуляции IgG-обработанными стафилококками хемилюминесценция составила 2 368 555

10 имп/мин, необработанными стафилококками — 407 730 имп/мин. Заключение: Fc-рецепторы нейтрофилов исследуемой крови функционально активны, так как наблюдается значительная разница между показателя15 ми хемилюминесценции, индуцированной

IgG-обработанными и необработанными стафило кокка ми, Таким образом, изобретение позволяет в несколько раз уменьшить обьем исследуе20 мой крови, исключить сложные предварительные процедуры обработки крови, сократить в 2-2,5 раза время определения.

Формула изобретения

Способ определения активности рецеп25 торов нейтрофилов человека, включающий забор периферической крови, обработку нейтрофилов специфическими для их Fc u

СЗв-рецепторов стимуляторами, связанными с частицами-носителями, инкубацию сус30 пензии клеток с последующим измерением люминолэависимой хемилюминесценции по сравнению с контролем, о т л и ч а ю щ ий с я тем, что, с целью упрощения и ускорения определения используют цельную пери35 ферическую кровь при разведении физиологической средой в соотношении

1; 50-1: 150.

* Штамм S. aureus М 141 со слабыми

40 адгезивными свойствами в отношении нейтрофилов человека депонирован в научно-исследовательском институте стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им, Л.А. Тарасевича МЗ СССР в ян45 варе 1983 г., штамму присвоен N 120.