Штамм бактерий flаvовастеriuм ваlusтinuм - продуцент рестриктазы fвl 1

 

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии Цель изобретения - получение нового ытяммч не тогбова тельного к. питательным средам и синтезирующего рестриктаэу Fbl I способную узнавать и расщеплять последовать нуклеотидов GT(A/C) (G/l) AC Штамм Flavobacterlum balustlnum ВКПМ В 4725

СО!ОЗ:.;ОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИНЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (5!) 5 С 12 N 9! 14

ГОСУДЛРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ЙЕСЩфущ " E" NO- 1ЕХяцщщ ьИБЛИОТЕКА

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4718579/13 (22) 11.07.89 (46) 07.11,91. Бюл. М 41 (71) Научно-исследовательский конструкторско-технологический институт биологических активных веществ Научно-производственного объединения "Вектор" (72) Г.Д.Серов, Л.И.Пучкова, Н.И. Речкунова, С.Х.Дегтярев и Т.А.Терещенко (53) 577. 15(088.8) (56) Roberts R.l. Restriction enzymes and their

isochizomers. — Nucl. Acids Res, 1988, N. 16, р. 271 — 313. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ FLAVOBACTERIUM

ВАЮЯТ! NUM — П Р ОДУ Ц Е НТ P Е CTP И КТАЗЫ РВ1 1 (57) Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии. Цель изобретения

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии и представляет собой штамм, который может быть использован для получения рестриктазы Fbl I, узнающей и расщепляющий последовательность нуклеотидов GT(А/С) (G/T) АС, Рестриктаза Fbi I узнает и специфически гидролизует ДНК по последовательности

GT(A/С) (G/Т) АС и является иэошиэомером рестриктазы Асс1.

Известен штамм Flavobacterium АТСС

33487, являющийся продуцентом рестриктазы Fba1, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов TGATCA, являющейся изошиэомером Bcl1.

Наиболее близким в предлагаемому штамму является штамм Acinetobacter,„, АЗ „„1689400 А1 — получение нового штамма, не требовательного к питательным средам и синтезирующего рестриктазу Fbi I, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов GT(A/С) (G/T) АС. Штамм

Flavobacterlum balustlnum ВКПМ В-4725

{324) получен vaK контаминант в результате поиска продуцентов растриктаэ среди микроорганизмов, не требователен к питательным средам, растет на доступной дешевой среде отечественного производства, содержит только одну рестриктазу Fbt i по сравнению с тремя рестриктазами известного штамма. Выход фермента РЫ I составляет

2000 ед. акт/г влажной биомассы. Штамм продуцирует рестриктаэу Fbi I, идентичну)о

Асс I и заменяющую ее в генно-инженерных работах.

calcoaceticus — продуцент рестриктазы Accl. узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов GT(A/С) (6/Т) АС

Недостатком известного штамма является то, что он продуцирует три рестриктазы

Accl, Accll, Acclil, что усложняет процесс выделения целевого фермента.

Цель изобретения — получение нового штамма, не требовательного к питательным средам и синтезирующего рестриктазу Fbi I, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов GT(A/С) (6/Т) АС.

Штамм Fiavobacterium balustinum

ВКПМ В вЂ” 4725 (324) получен как контаминант в результате поиска продуцентов рестриктаз сред микроорганизмов, взятых из различных мест обитания.

1689400

Предлагаемый штамм Fi. F3alustinum 324 характеризуется следующими признаками.

Культурно-морфологические свойства.

Клетки представляют тонкие со слегка закругленными концами грамотрицательные палочки размером 0,5х1, 5х1,8 мкм, трансформирующиеся в конце стационарной фазы роста в кокковидную форму, располагающиеся по одной или парами. На питательном агаре через 16-18 ч инкубации при 30 С образуют круглые с ровными краями, слегка выпуклые, полупрозрачные желтоватые колонии размером до 1 — 1,5 мм в диаметре.

Интенсивность пигментообразования зависит от увеличения времени инкубации и снижения температуры. На триптозном агаре колонии сначала голубоватые, а через двое суток становятся ярко-желтые, Консистенция колоний слизистая. Посев в жидкую среду приводит к ее равномерному помутнению, На среде Эндо розовые колонии появляются на 3-е сутки. На этаноламмонийной среде раста нет. На питательном агаре при

5 С и в присутствии 6 ) -ного хлористого натрия рост появляется на 2-е сфтки.

Физиолого-биохимические свойства.

Тест на оксидазу положительный, реакции на ацетоин и с метилсвым красным отрицательные. Проба на сероводород отрицательная, на индол положительная.

На средах Гисса ферментирует без гаэообразования глюкозу, мальтоэу, маннозу. Не ферментирует лактозу, ксилозу. арабинозу, рафинозу, маннит, дульцит, инозит. Окисляет 10%-ную глюкозу и мальтозу, Желатин гидролиэует на 5-е сутки. Нитраты, редуцирует, цитраты не ассимилирует, проба на

Р-галактозидаэу отрицательная, на эскулин и фосфатозу — положительные. Малонат не утилизирует. Лизин, аргинин, орнитин и фенилаланин не ферментирует.

Отношение к антибиотикам.

Культура устойчива к пенициллину, ампициллину, мономицину, неомицину, канамицину, оксациллину, чувствительна к тетрациклину, стрептомицину, олеандомицину, левомицетину, эритромицину, карбенициллину, линкомицину, гентамицину. рифампицину.

Штамм хранят в лиофильно-высушенном состоянии и на питательном агаре под ваэелиновым маслом, Для культивирования Fl.bafustinum 324 применяют питательную среду следующего состава, дистиллированная вода 1000,0; сухой дрожжевой экстракт 20,0; уксуснокислый натрий 2,0, сернокислый магний 0,2, фосфорнокислый калий 2,0. Готовая среда имеет рН 7,?. Культивирование проводят при 30 С со скоростью вращения качалки

200 об/мин до поздней логарифмической фазы роста. Выход клеток 3,0 — 3,5 г/л культурал ь ной среды, Выход фермента Fbi составляет 2000 ед.акт/г влажной биомассы, Полученная рестриктаза ЕЫ l характеризуется следующими.свойствами: узнает и специфически расщепляет последовательность нуклеотидов; оптимальное значение рН для действия рестриктазы 7,5; оптимальная температура действия 37 С; сохраняет свою активность при выдерживании не менее 10 мин при

50 С; ингибируется при концентрации NaCI

20 мМ, Пример 1, Получение биомассы

Flavobacterium balustinum 324.

Клети Р1;Ва1озбпит 324, хранящиеся под слоем вазелинового масла при 4 С, высевают на скошенном триптозный агар и инкубируют при 30 С 18-24 ч, Полученную культуру из расчета 10 используют для засева 200 мл среды. Культивирование проводят на термостатированной качалке в течение 16 — 18 ч, Выход сырой биомассы составляет 3,0 г/л культуральной жидкости, Пример 2. Выделение сайт-специфической эндонуклеаэы рестракции Fbi I.

5 г влажной биомассы суспендируют в

20 мл 0,02М трис-HCI - буфера (рН 7,5), содержащего 10 М P — меркаптоэнтанола и

0,1 Д тритон Х-100, и разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т. Обломки клеток удаляют центрифугированием (12000 g, 30 мин) и надсадочную жидкость наносят на колонку с биогелем А 0,5 М (BloRadj объемом 500 мл, уравновешенную 0,02

М калий фосфатным буфером, содержащим

10 M P -меркаптоэтанола, 5х10 М ЭДТА

О,ЯМ NaCI и 0,1 / тритон х — 100 (буфер А).

Фермент элюируют TGM же буфером со скоростью 200 мл/ч. Фракции объемом 10 мл собирают и анализируют на присутствие активного фермента. Фракции, содержащие максимальную активность, объединяют и диализуют против 2 л 0,02М калий фосфатного буфера (рН 7,5), содержащего 10 Ð

-меркаптоэтанола и 5х10 М ЭДТА (буфер

В), меняя буфер дважды. Диализат наносят на колонку объемом 30 мл с ДЕАДЕ-целлюлозой (ДŠ— 53, Ийаопап), уравновешенную буфером В, Колонку промывают буфером В и адсорбированный фермент элюируют 300 мл градиента NaCI (0,0-1,0 М) в буфере В.

Фракции, элюируемые.при 0,35-0,48 М

NaCl, содержат рестриктазу Fbt 1, Дальнейшую очистку фермента. проводят на фосфоцеллюлозе Р-!I (Whatman). После диалиэа

1б89400 против 2 л буфера В фермент наносят на колонку с P-II объемом 10 мл. Элюцию фермента проводят 200 мл градиента NaCt(0,0—

1,0 M) в буфере В. Фракции, содержащие рестриктазу Fbl 1, элюируемые при 0,25—

0,33 M NaCI. объединяют и диализуют против буфера В, содержащего 0,1 M NaCI u

50 -ный глицерин.

Формула изобретения

Составитель И.Чаплина

Редактор И.Дербак - Техред M,Ìoðãåíòàë Корректор М.Демчик

Заказ 3787 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственн -издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина. 101

Ферментный препарат хранят при20 С. Выход фермента 2000 ед. акт./r биомассы, активность 2000 ед./мл.

3а единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага Л в течение 1 ч при 37 С.

Определение последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой Fbl I.

Для определения последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой Fbl

1, проводят гидролиз ДНК фагаil рестриктазами Fbl I по отдельности, а также совместный гидролиз этими рестриктазами, Электрофореграфически определяют продукты гидролиза ДНК. Наблюдаемая картина полного совпадения фрагментов, полученных при гидролизе ДНК рестриктазами

ЕЫ! и Acct порознь и совместно, указывает на то, что рестриктаза Fbl I является изоши5 зомером рестриктазы Acct. узнает и расщепляет последовательности нуклеотидов

GT(A/C)(G/T)AC..

Штамм обладает следующими преимуществами по сравнению с известным:

10 штамм содержит только одну рестриктазу

Fbl 1 по сравнению с тремя рестриктазами, продуцируемыми известным штаммом, а также растет на доступной дешевой среде отечественного производства.

15 Поскольку рестриктаза Fbl I узнает и расщепляет последовательность нуклеотидов GT(A/Ñ)(G/Т)АС, она может заменить рестриктазу Асс I во всех генно-инженерных работах.

Штамм бактерий Ftavo bacterium

balustinum — продуцент рестриктазы Fbl!.