Штамм бактерий кlевsiеllа рnеuмоniае-продуцент рестриктазы кр @ 378 1

 

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии. Целью изобретения является выявление штамма Klebslella pneumoniae ВКПМ В-4894 (378), нетребовательного к питательным средам, обеспечивающего более высокий выход рестриктазы, способный узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов CCGCGG. Штамм получен в результате поиска продуцентов рестриктаз, выделен из воздуха, растет на простой дешевой питательной среде отечественного производства , обеспечивает повышенный выход рестриктазы при более простом экономичном способе выделения фермента по сравнению с известным. Из 1 г влажной биомассы выделяют40000 ед акт. фермента с активностью 30000 ед акт/мл

СО!ОЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)з С 12 N 9/14, 1/20

ГОСУДАРСТВЕ ННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4724899/13 (22) 20.06.89 (46) 30.06.91. Бюл. М 24 (71) Научно-исследовательский конструкторско-технологический институт биологически активных веществ (72) И.С. Андреева, Г.Н. Афиногенова, Ю,П. Зернов, Л,Р, Лебедев и Н,М, Пустошилова (53) 577,15 (088.8) (56) Wani А.А., Stephens R,Å., Ambrosto $.М., Hart К,Ч1. А sequence specific endonuciease

from Micrococcus radiodurans - Bioch. апб

Bioph. Асса, 1982, 697, р. 178-184.

Патент CLLIA К 4688631, кл, С 12 N 9/22, 1987. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ KLEBSIELLA

PNEUMONlAE — ПРОДУЦЕНТ РЕСТРИКТАЗЫ Крп 378 1, Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии, в частности к получению рестриктазы, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов CCGCGG, Целью изобретения является выявление штамма Klebsiella pneumoniae ВКПМ B4894 (378), нетребовательного к питательным средам, обеспечивающего более высокий выход рестриктазы, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов CCGCGG, Штамм Klebslelia pneumoniae 378 выделен из воздуха в результате поиска штаммов — продуцентов рестриктаз.

Штамм Kiebslella рпенглоп1ае 378 харак.Теризуется следующими признаками.

„„ Ц,, 1659480 А1 (57) Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии, Целью изобретения является выявление штамма Klebslelia

pneumoniae ВКПМ В-4894 (378), нетребовательного к питательным средам. обеспечивающего более высокий выход рестриктаэы, способный узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов

CCGCGG. Штамм получен в результате поиска продуцентов рестриктаз, выделен из воздуха, растет на простой дешевой питательной среде отечественного производства, обеспечивает повышенный выход рестриктазы при более простом экономичном способе выделения фермента по сравнению с известным. Из 1 г влажной биомассы выделяют 40000 ед. акт, фермента с активностью 30000 ед. акт./мл.

Морфологические признаки. Клетки в виде укороченных палочек часто овальной формы, неподвижные споры не образуют., . грамотрицательные, как правило имеют капсулу, длина и толщина клеток колеблются от 0,5 до 7 мкм и от 0,3 до 1,5 мкм соответственно, располагаются клетки единично, парами, редко цепочками.

Культуральные признаки. На плотных питательных средах образует, как правило, белесые, выпуклые, блестящие колонии, непрозрачные, встречаются колонии отличные по морфологии от основного типа — мелкие суховатые, крупные прозрачные, отличающиеся друг от друга консистенцией колонии, 1659480

Оптимальная температура роста штамма 30 — 37 С, предел от 12 до 43 С, оптимум рН 7,2.

Физиолого-биохимические признаки, Штамм Klebsielia pneumoniae 378 отличает высокая биохимическая активность: усваивает глюкозу, лактозу, маннит, сахарозу, дульцит, рамнозу, ксилоэу, мальтозу, сорбит, арабинозу, рафиноэу, глицерин, крахмал; восстанавливает нитраты, положителен по каталазе, лизиндекарбоксилазе, в реакции Фогес-Проскауэра; усваивает малонат, цитрат; не выделяет индол, сероводород; отрицателен по уреазе, орнитиндекарбоксилазе, аргининдегидролазе, в реакции с метиловым красным, по оксидазе, не разжижает желатин. Соотношение Г+ Ц

55,4 моль. .

Штамм Klebsiella pneumoniae 378 обладает устойчивостью к пенициллину, эритромицину, олеандомицину, оксациллину. ристомицину, сульфатиазолу, менкомицину, чувствителен к тетрациклину, стрептомицину, мономицину, неомицину, левомицетину, канамицину, полимиксину, ампициллину, гентамицину, рифампицину, слабо чувствителен к карбенициллину.

Штамм хранится в жидкой питательной среде с добавлением глицерина до 15 при минус 60 С.

Продуцируемая предлагаемым штаммом рестриктаза Крп 378 1 характеризуется следующими свойствами: узнает и специфически расщепляет последовательность нуклеотидов CCGCGG; оптимальное значение рН для действия рестриктазы 7,5 — 8,5; для проявления активности рестриктазы требуются ионы Mg, оптимальная концентраг+ ция 10 мМ, оптимальная концентрация NaCI в реакционной смеси 50-70 мМ; оптимальная температура 37 С.

Для поддержания штамма Klebsiella

Р378 используют рыбный питательный агар (РПА).

Для культивирования и ферментации К, pneumoniae 378 применяют питательную среду следующего состава, г/л дистиллированной воды:

Пептон 10

Дрожжевой экстракт 5

NaCI 5

Глюкоза добавляется перед засевом до

1о

Культивирование проводят при 30 С с хорошей аэрацией (200 об/мин) на качалке в течение 15-16 ч.

Выход биомассы: 8-12 г/л культуральной жидкости, Выходрестриктазы Крп 3781:40000 ед,акт/г биомассы, Пример, Культивирование штамма и получение биомассы, Клетки Klebsiella pneumoniae 378 размораживают при 37 С и высевают в жид5 кую питательную среду, содержащую пептон (10 г), экстракт (5 г), NaCI (5 г) и дистиллированную воду до 1 л. Глюкозу добавляют перед засевом до 1, После 24 ч инкубирования в термостате при 30 С

10 штамм высевают на плотную среду с РПА для получения отдельных колоний, Выращивают при тех же условиях. Выросшие клетки переносят петлей с агара в колбы с 50 мл жидкой питательной среды для получения

15 инокулята. Инкубируют на качалке (200—

220 об/мин) 24 ч при 30 С.

Полученным инокулятом засевают объем среды (качалочные колбы по 250 мл среды), предназначенный для ферментации, из

20 расчета 1,0 мл инокулята (стационарной культуры) на 100 мл среды. Инкубируют при тех же условиях в течение 20 ч, После охлаждения клетки собирают центрифугированием при 5000 об/мин, Выход биомассы 9 г

25 влажных клеток на 1 л среды.

Выделение и очистка рестриктазы.

4 r клеток суспендируют в 10 мл буфера

А, содержащего 10 мМ трис-НС1, рН 7,6, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 0,1 мМ ЭДТА, и

30 разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе. Обломки клеток удаляют центрифугированием (18000 об/мин, 40 мин при 2 С).

Надосадочную жидкость собирают, добавляют к ней 2 М КС! до конечной концентра35 ции 0,1 М и 10 -ный полиэтиленимин до конечной -концентрации 0,1 . Смесь тщательно перемешивают и выдерживают. во льду в течение 30 мин, затем центрифугируют (6000 об/мин, 10 мин при 2 С). Надоса40 дочную жидкость отбирают и.добавляют сульфат аммония до 70 -ного насыщения (при перемешивании на магнитной мешалке), Смесь выдерживают во льду в течение 30 мин, затем центрифугируют

45 (6000 об/мин, 10 мин при 2 С). Супернатант отбрасывают, осадок растворяют в 10 мл буфера А и диализуют против 300 мл буфера

А в течение 2 ч; Далее раствор белков наносят на колонку (2х20 см) с ДЕАЕ-целлюло.50 зой (ДЕ-52) и промывают буфером А до исчезновения УФ-поглощающего материа- ла в элюате, Адсорбированный материал элюируют 400 мл линейного градиента KCi (0-0,8 М) в буфере А. Аликвоты из каждой

55 фракции(по 2 мкл) анализируют на содержание рестриктаэы, инкубируя 30 мин при

37 С с 1 мкг ДНК фага il и анализируют электрофорезом в геле агарозы. Фракции, содержащие фермент, объединяют (общий обьем 30 мл) и наносят на колонку (1,2 5 см) 1659480

Полученный ферментный препарат свободен от значительных примесей неспецифических нуклеаз и фосфатаэ. При инкубации 120 ед. акт. фермента с 1 мкг ДНК фага А в течение 2 ч при 37 С наблюдается стандартный набор фрагментов ДНК. При

Составитель И. Привалова

Редактор Л. Веселовская Техред М.Моргентал Корректор Н. Король

Заказ 1821 Тираж 376 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101 с гидроксилапатитом. Колонку промывают буфером Б, содержащим 10 мМ фосфата калия, рН 7,6, 10 MM 2-меркаптоэтанола и

0,1 мМ ЭДТА, до исчезновения УФ-поглощающего материала в элюате. Адсорбированный материал элюируют 150 мл линейного градиента фосфата калия, рН 7,6 (0,01-0,6 M) в буфере Б. Аликвоты из каждой фракции (по 2 мкл) анализируют на содержание рестриктазы. Фракции, содержащие рестриктазу Крп 378 1, объединяют (общий объем 15 мл) и диализуют в течение 16 ч против 150 мл буфера А, содержащего 507ный глицерин, и хранят при -20 С.

Выход продукта 40000 ед.акт. на 1 г биомассы. Полученный препарат имеет концентрацию 30000 ед,акт./мл.

Активность фермента определяют в

20 мкл реакционной смеси, содержащей

10мМтрис-НО, рН 8.0, 10мМ М9О2, 50мМ

NaCI, 10 мМ 2-меркаптоэтанола и 1 мкг ДНК фага ). при 37 С. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного специфического расщепления 1 мкг ДНК фага Х за

1ч при 37 С, инкубации 5 ед.акт, фермента с 1 мкг ДНК фага il в течение 1 ч при 37 С фрагменты

ДНК сшиваются ДНК-лигазой и повторно гидролизуются рестриктазой Крп 378 1.

5 Для определения последовательности нуклеотидов узнаваемой рестриктаэой Крп

378 1 проводят гидролиз ДНК фага Арестриктаэами Крп 378 1 и Sst II, а также совместный гидролиэ этими рестриктаэами.

10 Наблюдаемая картина полного совпа дения фрагментов, полученных при гидролизе ДНК рестриктазами Крп 378 1 и Sst II порознь и совместно, указывает на то, что рестриктаза Крп 378 1 является изошизоме15 ром рестриктазы Sst II, узнает и расщепляет последовательность нуклеотидов CCGCGG.

Полученный штамм по сравнению с известным обеспечивает повышенный выход целевого фермента, составляющий

20 40000 ед.акт/г биомассы.

Для культивирования предлагаемого штамма используется простая среда из доступных компонентов.

Поскольку рестриктаза Крп 378 1 имеет

25 сайт узнавания CCGCGG. идентичный сайту узнавания Sst il и известного, она может заменить эти рестриктазы во всех генно-инженерных работах.

30 Формула изобретения

Штамм бактерий Klebslella pneumonlae

ВКПМ В-4894 — продуцент рестриктазы Крп

378 1,