Штамм бактерий flаvовастеriuм аquатilе - продуцент рестриктазы fau i

 

Изобретение хранится во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов ВНИИГенетика под коллекционным номером В-4724, получен в результате систематического поиска штаммов-продуцентов эндонуклеаз рестрикции в природных условиях. При культивировании штамма в свежей питательной среде (МПБ) при 25°С с аэрацией два объема в минуту до достижения логарифмической фазы роста получают урожай клеток. Биомассу осаждают центрифугированием, дезинтегрируют ультразвуком и подвергают хроматографической очистке. В результате получают рестриктазу FAU 1, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5<SP POS="POST">Ъ</SP> - CCCGC - 3<SP POS="POST">Ъ</SP>, 3<SP POS="POST">Ъ</SP> - GGGCG - 5<SP POS="POST">Ъ</SP>. РЕСТРИКТАЗА ДАННОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ ЯВЛЯЕТСЯ НОВЫМ ОБЪЕКТОМ, ЕЕ ИСПОЛЬЗУЮТ В ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ. 1 ТАБЛ.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (sl)s С 12 N 9/14, 1/20

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4724912/13 (22) 26.07.89 (46) 07.07.91. Бюл. N. 25 (71) Научно-производственное объединение

"Вектор" и Лимнологический институт СО

АН СССР (72) В.С.Дедков, С.Х.Дегтярев, H.È,Ðå÷êóíîва, В.Е.Репин, В,А.Верхоэина и Т.П.Виноградова (53) 577.15(088.8) (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ FLAVOBACTERIUM

AQUATILE — ПРОДУЦЕНТ РЕСТРИКТАЗЫ

FAN I (57) Изобретение хранится во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов ВНИИГенетика под коллекционным ноИзобретение относится к биотехнологии и представляет собой штамм, который может быть использован для получения рестриктазы Fan I, способный узнавать непалиндромную последовательность нуклеотидов в составе ДНК

5 -CCCGC-3

3 — GGG CG-5

Такая рестриктаза может быть применена в молекулярной биологии и генной инженерии как инструмент для вырезания структурных и регуляторных участков ДНК и является моделью для изучения белокнуклеиновых взаимодействий.

Новый штамм выделен в результате систематического поиска штаммов-продуцентов рестриктаз в пресной воде, используя методику скрининга, и хранится во всесоюзной коллекции промышленных микроорга„„3Ц „„1661213 А1 мером В-4724, получен в результате систематического поиска штаммов-продуцентов эндонуклеаз рестрикции в природных условиях. При культивировании штамма в свежей питательной среде (Mflb).при 25 С аэрацией два объема в минуту до достижения логарифмической фазы роста получают урожай клеток. Биомассу осаждают центрифугированием, деэинтегрируют ультразвуком и. подвергают хроматографической очистке. В результате получают рестриктазу

Fan 1, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5 — CCCGC3, 3 -GGGCG-5 . Рестриктаза данной специфичности является новым объектом, ее используют в генной инженерии и молекулярной биологии. 1 табл. ниэмов ВНИИ генетика, коллекционный номер В-4724, ° ааай

Штамм Flavobacterlum aquatlle В-4724 0с, характеризуется следующими признаками. О

Морфологические признаки.

Клетки неподвижные, грамотрицательные палочки. Размеры 1-2 мкм длиной, 0,5 — 0,7 мкм шириной. Иногда образуют нити длиною до 6 мкм. Спор не образуют. 64

Жгутики не обнаруживаются. Колонии бледно-оранжевые, гладкие, блестящие, выпуклые с ровными краями, авеей

Физиологические признаки,Каталазоположительный, оксидаэоположительный. Азроб. Аэробно использует глюкозу без образования газа и кислоты, Реакция Фогес-Проскауэра отрицателъная, В анаэробных условиях брожение глюкозы и рост отсутствует. Гидролизует желатин, но не целлюлозу и крахмал. Восстанавливает

1б61213

50%-ный глицерин

25

35

5 -ССС6С-3

55 нитраты в нитриты. Индолположительный.

B аэробных условиях медленно образует кислоту из мальтозы, маннозы, арабинозы, сахароэы, но не глюкозы, рамнозы, дульцита, маннита, лактозы, сорбита, инозита, глицерина и спирта. Чувствителен к ампициллину, тетрациклину, стрептомицину, Устойчив к хлорамениколу, канамицину.

Доли GC в ДНК вЂ” 33% (по плавучей плотности).

Культуральные свойства, Дает рост на твердых и жидких питательных средах на основе мясопептонного бульона. В жидкой среде без встряхивания образует равномерную нить. Обнаруживайтся рост при 15 — 30 С, Оптимальной для акоста является 25-30 С. Наблюдается рост при концентрациях NaCl 0 — 1,5%, оптимальные значения 0-0,7%. Оптимальными являются нейтральные значения рН. При рН 5 и

9 роста не обнаруживается.

Дает активный рост на бульоне Хоттинегра. Требователен к аэрации.

Хранение штамма осуществляют под ваэелиновым маслом в 30%-ном глицерине при -70 С.

Штамм F,aquatile В-4724 содержит уникальную рестриктазу с ранее неизвестной специфичностью

5 -CCCGC-3

3 -GGGCG-5

Изобретение иллюстрируется следующими примерами, Пример. Получение биомассы и выделение фермента, Ночную культура F./aquatile засевают в свежую питательную среду МПБ. Культиви руют при 25 С с аэрацией два объема в минуту при 2000 об/мин мешалки до дости жения средней логарифмической фазы роста. Клетки осаждают центрифугированием при 4 С, Осадок оранжевый, рыхлый. Выход биомассы 1,4 г/л культуральной жидкости, 10 r клеток суспензируют в 50 мл 0,02

М трис- HCI буфера, рН 7,5, содержащего

1х10 М Р-меркаптоэтанол и 0,1% тритон

Х-100, и разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе. Обломки клеток удаляют центрифугированием (12000xg, 30 мин) и надосадочную жидкость наносят на колонку с фосфоцеллюлозой (P-11, Whatman) объемом 30 мл, уравновешенную 0,002 M калийфосфатным буфером, рН 7,5, содержащим

-з

1х10 M P-меркаптоэтанол и 5х10 M ЭД-4

ТА (буфер А). Колонку промывают буфером

А и элюируют фермент 300 мл градиента

NaCI 0,0 — 0,1 M в буфере А. Фракции, содержащие рестриктазную активность, элюируемые при 0,6 — 0,7 M NaCI, объединяют и диализуют против 2 л буфера А. Фермент после диализа наносят на колонку с гепарин-сефарозой объемом 5 мл, уравновешенную буфером А, и промывают колонку тем же буфером. Элюцию фермента прводят 100 мл градиента NaCI 0,0 — 1 M в буфере А.

Фракции, содержащие рестриктазу, элюируемые при 0,32 — 0,37 M NaCI. объединяют и диалиэуют против буфера А, содержащего

3а единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага Л в течение 1 ч при 50 С, Ферментный препарат хранится при -20 С, Выход фермента 100 ед./г биомассы, активность 100 ед./мл.

Определение последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой Fan I.

Для определения последовательности узнавания рестриктазы Fan i проводят сравнение величин длин фрагментов, полученных экспериментально при гидролизе ДНК

pBR 322 рестриктазой Fan I, с величинами длин фрагментов, рассчитанных для различных тетра-дента- и гексануклеотидных по.следовательностей. Обнаружена только одна последовательность, для которой рассчитанные величины фрагментов хорошо совпадают с экспериментальными (см, таблицу).

В таблице приведены величины длин фрагментов. установленные экспериментально и рассчитанные теоретически для последовательности 5 -CCCGC-3 . Таким образом сайтом узнавания фермента Fan I

3 -GGGCG-5 является последовательность

3 -GGGСС-5

Для подтверждения установленной последовательности узнавания проводят сравнение величин длин фрагментов ДНК фага Л С 1857, полученных экспериментально и рассчитанных для последовательности

5 -CCCGC-3

3 -GGGCG-5 .

Обнаруженный штамм является уникальным, т.к. продуцируемая в нем рестриктаза узнает и расщепляет последовательность нуклеотидов

5 -CCCGC-3

3 -GGGCG-5, Это новый не известный ранее продуцент рестриктазы, не имеющий аналогов, Формула изобретения

Штамм бактерий FIavobacterium

aquatiIe ВКПМ В-4724 — продуцент рестриктазы Fan I, 1661213

Составитель И. Привалова

Редактор М. Стрельникова Техред М,Моргентал Корректор T. Колб

Заказ 2097 Тираж /

Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101