Штамм культивируемых клеток сердца и языка эмбриона сеrсорнiтнесus аетнiорs, используемый для выращивания вирусов

 

Изобретение относится к вирусологии, биотехнологии и медицине и касается получения нового штамма культивируемых гетероллоидных клеток сердца и языка эмбриона африканской зеленой мартышки для использования в вирусологической практике. Целью изобретения является получение штамма культивируемых гетероплоидных клеток сердца и языка эмбриона африканской зеленой мартышки ( Cercophithecus aethiops), используемого для выращивания вирусов. Указанная цель достигается выделением из соответствующих органов первичных культур с последующей оценкой их пролиферативной активности и способности к субкультивированию . Полученный при этом штамм депонирован в ВСКК (II) за № 324/88 и обладает высокой репродуктивной активностью в отношении вирусов полиомиелита, чумы плотоядных , клещевого и японского энцефалитов. Ё

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я}5 С 12 N 5/00, 5/02

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

6 (21) 4634929/13 (22) 09.01,89 (46) 23.11.91. Бюл. М 43 (71) Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР и Томский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток (72) Л. Л. Миронова, Н. Е, Гольдрин, В. И. . Кашликова, Н. В, Кузнецова, С. И. Кудинова.

В. И. Стобецкий, Е. М. Хороших. Т, Л. Мирютова, В. И. Чернышев, В. Я. Кармышева, В. Д. Попова и Г. А. Алпатова (53) 616.998 + 616,98.1(088.8) (56) Лабораторная диагностика вирусных и риккетсиозных заболеваний./Под ред. Э. Л.

Леннета и К. Шмидт, — M.: Медицина, 1974, с. 89. (54) ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК СЕРДЦА И ЯЗЫКА ЭМБРИОНА

CERC0PHITHECUS AETHI0PS. ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ ВИРУСОВ

Изобретение относится к вирусологии, биотехнологии, медицине и касается получения нового штамма культивируемых гетероплоидных клеток сердца и языка эмбриона африканской зеленой мартышки

4179 для использования в вирусологической практике, Целью изобретения является получение штамма культивируемых гетероплоидных клеток сердца и языка эмбриона африканской зеленой мартышки (Cercophithecus

aethiops), используемого для выращивания вирусов с неограниченным количеством суб кул ьти ви рова н ий.

ÄÄ 5U ÄÄ 1693044 А1 (57) Изобретение относится к вирусологии, биотехнологии и медицине и касается получения нового штамма культивируемых гетероплоидных клеток сердца и языка эмбриона африканской зеленой мартышки для использования в вирусологической практике, Цепью изобретения является получение штамма культивируемых гетероплоидных клеток сердца и языка эмбриона африканской зеленой мартышки (Cercophlthecus aethlops), используемого для выращивания вирусов. Указанная цель достигается выделением из соответствующих органов первичных культур с последующей оценкой их пролиферативной активности и способности к субкультивированию. Полученный при этом штамм депонирован e BCKK (ll) за N 324/88 и обладает высокой репродуктивной активностью в отношении вирусов полиомиелита, чумы плотоядных, клещевого и японского энцефалитов.

Пример 1. Штаммп 4179 получают следующим образом.

Все первичные культуры готовят из соответствующих органов и тканей эмбриона африканской зеленой мартышки (Cercophithecus aethiops), выделенного путем кесаревого сечения. Обезьяна М 4179 прошла 45-суточный карантин и была клинически здорова.

Дискретные клетки получают с помощью метода щадящей трипсинизации кусочков тканей и органов 0,25%-ным раствором трипсина при чередующихся контактах с питательной средой.

1693044

Клетки ресуспендируют со средой Игла

МЕМ и 10 CKPC и эксплантируют 1012х10 на 1 мл. Сосуды с клетками инкубируют при 30 С. В первичных культурах монослой развивается за 8-10 сут. В зависимости от срока формирования монослоя проводят первое субкультивирование, а все последующие по четкому графику — два раза в неделю, так что интервал между перевивквми постоянно равен 3-4 сут. Исключение этого составлял штамм перевиваемых клеток стенки кишечника, так как его клетки обладают более низкой профилиративной активностью и субкультивирование проводили один раз в неделю. Кратность рассева для всех культур колебалась от 1;2 до 1:3. В процессе пассажей используют среду того же состава.

Отделение клеток от стекла осуществляют 0,25 -ным раствором трипсина, подогретым до 37 С.

Криоконсервируют клетки с использованием 10 глицерина, 10 CKPC и 80 среды роста. При восстановлении после замораживания используют среду роста.

В процессе субкультивирований было установлено, что наибольшей пролиферативной активностью обладала культура клеток сердца и языка, обозначенная как штамм 4179, Создан банк посевных клеток на уровне

80-го пассажа в количестве 296 ампул, каждая из которых содержит 5х10 клеток.

Штамм 4179 депонирован в специализированной коллекции перевиваемых

Соматических клеток позвоночных научноисследовательского института вирусных инфекций, г. Свердловск, за N 324/88 (ВСКК/П).

Штамм 4179 характеризуется следующими признаками.

Культуральные свойства.

После первичной эксплантации клеточный слой сформировался на 5-е сутки, Все последующие перевивки проводили два раза в неделю на 3-4-е сутки. Кратность рассева до 38-ro пассажа 1:2, затем до 45-го 1;3, с 46-ro до 88-ro (срок наблюдения) 1:3 — 1;5, Культура в процессе изучения пропассирована 128 раз. Кратность рассева зависит от качества сред и сывороток.

Первичная культура клеток сердца и языка имела смешанный состав. Отмечены фибробластоподобные клетки, округлые эпителиоидные и удлиненные миобласты.

Укааанная гетерогенность клеточного состава сохраняется примерно до 19-ro naccaжа, когда отмечено преобладание фибробластоподобных клеток над остальными. Примерно через следующие 10 пассажей количество эпителиоидных клеток значительно увеличилось, начиная с 36-ro nacсажа в культуре регистрируют примерно равное количество фибробластоподобных и

5 эпителиоидных клеток. Полиморфизм клеточного состава сохраняется и в последующих

20 пассажах, но начиная с 56-го пассажа фибробла стоп одобн ые и реоблада ют. До конца наблюдения культура по клеточному составу остается смешанной, Смена серий сывороток и сред вызывает изменение

10 внешнего вида культуры с незначительным преобладанием то одного, то другого вида клеток, 15 Для перевивок применяют среду Игла

МЕМ с 10 СКРС. В качестве криопротектора используют 10 глицерина, клетки ресуспендируют в среде Игла МЕМ, содержащей 10 СКРС, с концентрацией

20 2х10 на 1 мл. Жизнеспособность клеток составляет 85+. 5 .

Создан банк посевных клеток на уровне

80-го пассажа в количестве 296 ампул, каждая из которых содержит 5 10 клеток.

25 Проведеноповторное изучение культуральных свойств клеток посевного банка и показана их стабильность на протяжении 50 пассажей (срок наблюдения). Количество клеток в одной 1,5-литровой матрасной кол30 бе колеблется в зависимости от кратности рассева от 35 до 56 х 10, Культура сохраняется на стекло без смены среды и перевивок при кратности рассева 1:3 не менее трех недель.

35 При изучении видовой принадлежности показано, что изоферменты лактатдегидрогеназа и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа— энзимограммы обезьян.

Морфологические признаки.

40 Культура клеток сердца и языка африканской зеленой мартышки 4179 с помощью цитологических и цитохимических методов изучена на уровне 42-го. 60-го, 72-ro. 106-го и 112-го пассажей. Культура неоднородна

45 пр своему составу, что является следствием содержания в исходном материале клеточных элементов, являющихся производными почти всех зародышевых листков.

Основная масса клеток штамма 4179

50 (около 95 ) представлена фиброластоподобными и эпителиоидными клетками. Эпителиоидные — полигональные клетки с овальными и округлыми ядрами, варьирующими по величине в 1,5-2 раза. На препара55 тах, окрашенных гематоксилином и эозином. а ядрах таких клеток выявляются

1-4 ядрышка и мелкие глыбки хроматина.

При постановке реакции по Шабадашу в цитоплазме видны мелкие глыбки гликогена. Эти клетки делятся обычными двуполюс16930 14

55 ным митозом. Фибробластоподобные клетки — удлиненные с двумя или несколькими отростками, а также веретеновидные различной величины. Ядра в них овальные с 1-3 ядрышками и мелкими глыбками хроматина. Фибробластоподобные клетки часто располагаются тяжами и окружают эпителиодн ые.

На всех изученных пассажах обнаружены также округлые или отростчатые крупные многоядерные клетки, миобласты и небольшие мышечные трубочки. Содержание их меняются на разных пассажах и неоднородно даже по монослою.

В крупных многоядерных клетках число ядер варьировало от 3 до 15. Кроме того, в некоторых многоядерных клетках содержатся еще и многочисленные микроядра. В многоядерных клетках часто можно видеть многополюсные митотические деления с неравномерным расхождением группы хромосом к нескольким полюсам. Деление цитоплазмы при этом часто не наблюдается.

Отмечены митотические деления с асинхронным вступлением ядер в процесс кариокинеза, что позволяет наблюдать в одной многоядерной клетке одновременно несколько фаз деления. В ряде многоядерных клеток отмечено образование крупных ядер неправильной формы. В цитоплазме многоядерных клеток содержатся и глыбки гликогена, выявленные реакцией Шабадаша, В штамме 4179 миобласты и мышечные трубочки составляют менее 1 . Форма клеток миобластов вытянутая, ядро удлиненное, более компактное, чем у эпителиоидных и фибробластоподобных клеток. По мере пассажей число миобластов уменьшается. Мышечные трубочки отмечены до 112-го пассажа (срок наблюдения).

Они имеют удлиненную форму и обычно 3-4 округлых ядра, расположенных друг за другом, содержат в цитоплазме глыбки гликогена. Миофибрилл с поперечно-полосатой исчерченностью в них не отмечено.

По периферии единичных клеток разных типов происходит плазматоз, а также фрагментация, пикноз ядер и деструкция цитоплазмы отдельных стареющих клеточных структур, Содержание и локализация

ДНК и РНК, кислой и щелочной фосфатоз было обычное.

Внутриядерных и цитоплазматических включений, а также вакуолизации, характерных для цитопатологии, вызываемой вирусами, не обнаружено.

Кроме этого, установлено, что многоядерные и мышечные элементы штамма

4179 хуже сохраняются. в жидком азоте и при восстановлении их содержание значи5

35 тельно снижается, что приводит к изменению морфологии культуры, Так, например, восстановленная после хранения в жидком азоте культура на уровне 72-ro пассажа состоит преимущественно из фибробластоподобных и полигональных эпителиоидных клеток.

Такое строение штамма 4179 делает его перспективным для использования не только в вирусологии, но также для изучения процессов взаимодействия клеток разного происхождения, закономерностей митотического желения, избирательной чувствительности различных клеточных элементов к вирусам и химическим веществам.

Кариологические признаки.

Кариологический анализ штамма 4179 проведен на уровне 79-го пассажа. Изучено

100 метафаз и установлено, что штамм— гетероплоидный. Число хромосом колеблется от 61 до 148. Основную массу составляют клетки с числом хромосом от 71 до 110 (82 ) без узкого модельного класса. Наивысший процент (34 ) зарегистрирован в клетках, содержащих от 91 до 100 хромосом, следующая по величине группа (22 ) представлена клетками с числом хромосом от 71 до 80, наименьшая (4 ) — от 61 до 70.

В каждой метафазе содержится от двух до четырех маркерных ядрышкообразующих хромосом с типичной для данного вида животных морфологией.

Кариологические данные свидетельствуют о поликлональной структуре популяции данного штамма клеток.

Контроль штамма 4179 на посторонние контаминанты.

При обследовании клеток штамма на стерильность (наличие бактерий, грибов,. микоплазм) были получены отрицательные результаты на уровнях 4-128-го пассажей, При исследовании культуральных жидкостей и самих клеток на уровнях 35-ro, 58-го и 88-го пассажей в чувствительных клеточных системах — в первичной культуре клеток почек африканской зеленой мартышки, в двухштаммах диплоидных клеток эмбриона человека и в первичной культуре клеток почек кролика, а также в реакции гемадсорбции с эритроцитами морской свинки вирусы-контаминанты не выявлены.

При обследовании клеток штамма 4179 на тех же уровнях пассажей в опытах на новорожденных и взрослых белых мышах„ кроликах, морских свинках, куриных эмбрионах и иммунодепрессионных мышах линии

СВА посторонних агентов, в том числе онкогенных, не обнаружено.

1693044

Чувствительность к вирусам, Определена чувствительность штамма 4179 к заражению вирусами полиомиелита.

К первичному заражению без адаптации культура оказалась чувствительна к вак- 5 цинным штаммам Сэбина трех типов.

Максимальный титр (7,49 Ig БОЕ/мл) был получен со штаммом III типа. Для и II типов этот показатель колебался от 7,2 до 7,4.

Штамм 4179 чувствителен к заражению 10 вирусами клещевого и японского энцефалитов. В частности, титр вируса клещевого энцефалита достигал 9,8 Ig ЛДьо/мл.

Пример 2. Способ культивирования вируса полиомиелита, штамм Сабина тип I. 15

В матрасную колбу вместимостью 1,5 л с монослоем клеток 4179 на уровне 71-ro пассажа вносят подогретый до 37 С 0,25; ный раствор трипсина, Монослой ополаскивают несколько раз, жидкость удаляют, а 20 культуру помещают в термостат при 37 C на

1-2 мин, Затем колбу встряхивают до полного отделения клеток и вносят 500 мл среды роста, клеточную взвесь энергично встряхивают и разливают в 20 флаконов вместимо- 25 стью 100 мл по 25 мл в каждый. В качестве среды роста используют среду Игла MEM c

10 CKPC. Культуру инкубируют при 37 С в течение трех суток до момента формирования монослоя. 30

При заражении питательную среду удаляют, клеточный слой однократно промывают рабочим раствором Эрла и вирус полиомиелита вносят в разведении 10 с 15 мл среды ГЛАЭИ (0,5 гидролизата лак- 35 тальбумина на растворе Эрла с равным количеством среды Игла). Инфицированные культуры инкубируют при 34 С. Учет результатов проводят, начиная с вторых суток после заряжения. Титр вируса полиомиелита, 40 штамм Сэбина типа равен 7,2 Ig БОЕ/мл, Пример 3. Способ культивирования вируса полиомиелита, штамм Сабина типа !!, Культуру клеток штамма 4179 на уровне 45

71-го пассажа получают и заражают по способу, описанному в примере 1, при этом титр вируса составил 7,44 Ig БОЕ/мл.

Пример 4, Способ культивирования 50 вируса полиомиелита, штамм Сэбина типа

lll.

Культуру клеток штамма 4170 на уровне

71-го пассажа получают и заражают по способу, описанному в примере 1, при этом титр вируса составил 7,49 Ig БОЕ/мл.

Пример 5. Способ культивирования вируса клещевого энцефалита, штамм 139.

Культуру клеток штамма 4179 получают по способу, описанному в примере 1, Перед заражением питательную среду удаляют, вирус клещевого энцефалита, штамм 139, вносят в культуру клеток в полном объеме среды поддержки (среда Игла МЕМ с 2

CKPC) из расчета 5-10 ЛД/клетка. Инфицированные культуры инкубируют при 37 С.

Учет результатов проводят на четвертые сутки.

При титровании проб вируссодержащей жидкости на беспородных белых мышах массой 7-8 г инфекционная активность вируса клещевого энцефалита, штамм 139, составляет 7,9 Ig ЛДцо/мл.

Пример 6. Адаптационное пассирование вируса клещевого энцефалита, штамм

139.

С целью повышения инфекционной активности вируса клещевого энцефалита проводят адаптационное пассирование в культуре клеток 4179. Для этого вируссодержащую жидкость, полученную по способу, описанному в примере 4 (титр 7,9 lg

ЛД о/мл), переносят в культуру клеток штамма 4179, подготовленную по способу, описанному в примере 1. Заражающая доза и условия репродукции вируса те же. Процедуру повторяют дважды, Адаптационное пассирование приводит к увеличению титра инфекционной активности, определяемой на уровне 11-го пассажа

8,7 Ig ЛД о/мл, 111-ro пассажа — 9,8 Ig ЛДьо/мл.

Пример 7. Способ культивирования вируса японского энцефалита, штамм Я-47.

Культуру клеток штамма 4179 получают по способу, описанному в примере 1. Заражение клеток 4179 вирусом японского энцефалита, штамм Я-47, проводят по способу, о описанному в примере 4. Титр вируса на 4-е сутки после заражения равен 8,9 ig ЛДю/мл.

Формула изобретения

Штамм культивируемых клеток сердца и языка эмбриона Cercophlthecus acth!ops, BCKK(ll) N 324/88, используемый для выращивания вирусов,