Способ регенерации растений пшеницы в культуре тканей

 

Изобретение относится к биотехнологии , а именно к биотехнологическим исследованиям растений методом культуры клеток и тканей, и может быть использовано в работе по созданию новых форм растений, в частности сортов и исходных форм пшеницы , обладающих хозяйственно ценными признаками. Целью изобретения является повышение выхода регенерантов и их жизнеспособности . Способ предусматривает получение из основания листа каллуса с последующей регенерацией, при этом в процессе культивирования ступенчато изменяют концентрации фитогормонов и освещенность. 8 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (ч j5 С 12 N 5/04, А 01 Н 4/00

ГОСУДАРСТВЕ ННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4770553/13 (22) 20,12,89 (46) 30,12,91. Бюл. М 48 (71) Институт молекулярной биологии и био.химии им. M.À.Àéòõîæèна (72) М.К. Бегалиев, М. К. Карабаев и

Ж.К.Джардемалиев (53) 578.085.23(088.8) (56) Гапоненко А,К, и др. Получение сомаклональных линий у злаков. Доклад АН

СССР, 1985, т.283, M 6, с.1471 — 1475. ! (54) СПОСОБ РЕГЕНЕРАЦИИ РАСТЕНИЙ

ПШЕНИЦЫ В КУЛЬТУРЕ ТКАНЕЙ

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к биологическим исследованиям сельскохозяйственных растений методом культуры клеток и тканей, и может быть использовано в работе по созданию новых форм растений, в частности сортов и исходных форм пшеницы, обладающих хозяйственно ценными признаками.

Целью изобретения является повышение выхода регенерантов и их жизнеспособности.

Способ предусматривает получение каллуса из экспланта, индукцию образования морфогенного каллуса, регенерацию растений и укоренение с использованием питательных сред на основе среды МурасигеСкуга, в качестве экспланта используют основание листа, а концентрацию фитогормонов и интенсивность света изменяют ступенчато: перед высадкой на регенерационную среду каллусы, индуцированные при высоких. Ж, 1701744 А1 (57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к биотехнологическим исследованиям растений методом культуры клеток и тканей, и может быть использовано в работе по созданию новых форм растений, в частности сортов и исходных форм пшеницы, обладающих хозяйственно ценными признаками. Целью изобретения является повышение выхода регенерантов и их жизнеспособности. Способ предусматривает получение из основания листа каллуса с последующей регенерацией, при этом в процессе культивирования ступенчато изменяют концентрации фитогормонов и освещенность. 8 табл. (2-4 мгln) концентрациях 2,4-Д, постепенно адаптируют ко все более низким концентрациям этого гормона (от 2 до 0,1 мг/л) и условиям освещения (темнота — 500 — 1000 лк), затем в регенерационной среде ступенчато С1 увеличивают содержание зеатина (от 0,1 до

2 мг/л) при постоянной концентрации ИУК (0,01 мг/л) и повышают интенсивность света д от 1.000 до 2000 лк;для укоренения и повышения жизнеспособности растений ступенча- + то изменяют в среде для укоренения содержание ИУК от 0,1 до 0,5 мг/л, увеличивают освещенность до 4000 лк. Перед выа@иВ садкой в почву растения выдерживают в среде с половинным содержанием солей по

Мурасиге-Скугу (MC) и повышенной по сравнению с регенерационной средой концентрацией ИУК вЂ” 0,1 — 0,5 мг/л. Этим достигается стимуляция развития корневой системы, повышение жизнеспособности регенерантов, позволяющие предотвратить

1701744 или уменьшить "трансплэнтационный шок", обусловленный переносом растений из условий In vItro (пробирки) в in vlvo (почву), Разработанный способ дает возможность более тонко регулировать морфогенетиче- 5 ские реакции и адаптационные потенции культуры клеток и тем самым регенерировать растения из считающихся низкототипотентными тканей листа пшеницы.

Способ осуществляется следующим обi разом.

Зерновки озимой мягкой пшеницы (Tr, aestivum сорт "Прогресс" ) поверхностно стерилизуют последовательно в растворах диацида, этанола, трижды отмывают стерильной дистиллированной водой. и помещают на твердую солевую среду по MC u проращивают на свету 2000 100 лк при тем10

15 пературе 25 1 С,через 7-8 дней из проростков ную среду того же состава и культивируют

,, 2 — 3 недели до образования колоний со средним диаметром 8-10 мм. Далее последовательно осуществляют следующие этапы: а) перенос каллусов на среду того же состава, но с содержанием 1 мг/л 2,4-Д, культивирование 12 — 14 дней в темноте при

25 -0.5 С; б) пересадка каллусов на ту же среду с

0,7 мг/л 2,4-Д, культивирование 12-14 дней при освещенности 5002100 лк и 25t0,5 С; в) пересадка каллусов на среду с 0,5 мг/л 2,4-Д, культивирование 12-14 дней при освещенности 500+100 лк и 25+0,5 С; г) пересадка каллусов на среду с 0,3 мг/л 2,4-Д, культивирование 12 — 14 дней при 1000+100 лк и 2510,5 С; д) пересадка каллусов на среду с 0,1

45 мг/л 2,4-Д, культивирование 12 — 14 дней при 1000+100 лк и 25+0,5 С, Этап культивирования каллусов при концентрации 0,1 мг/л 2,4-Д существенного влияния на морфогенетическую активность ткани не оказывает и в целях ускорения регенерации его можно не проводить.

Указанная выше процедура последова50

55 тельного переноса каллуса на среды со все более понижающимися концентрациями

2,4-Д позволяет избежать некроза кэллуса, вычленяют стерильно базальную часть лис- 20 та. Сегменты из основания листа длиной

3 — 5 мм помещают на твердую питательную среду для каллусогенеза, содержащую соли по МС, 100 мг/л мезоинозита, 2 мг/л глицина, 0,5 мг/л никотиновой кислоты, 0,5 мг/л 25 пиридоксина, 1 мг/л тиэмина, 3% сахарозы, 0,7% агара, 2,4-Д при рН 5,7, Экспланты культивируют при 2515,5 С и относительной влажности воздуха 60 — 70%. Образовавшиеся каллусы переносят на свежую питатель- 30 наблюдаемого при прямом его переносе со среды для каллусогенеза на регенерационную, а также существенно увеличить выход эмбриогенного каллуса (примеры).

Далее эмбриогенные каллусы, характеризующиеся плотной зарнистой консистенцией, желтовато-зеленого цвета с четко выделяемыми участками из слабовакуолизированных клеток меристемоидного типа переносят на регегерационную среду. Последовательно проводят следующие операции; а) перенос эмбриогенных каллусов на среду, содержащую соли по МС, 100 мг/л мезоиноэита, 2 мг/л глицина, 0,5 мг/л никотиновой кислоты, 0,5 мг/л пиридоксина, 1 мг/л тиамина, 3 g, сахарозы, 0,7;4 агара, Концентрация фитогормонов — 0,5 мг/л эеатина, 0,01 мг/л ИУК, Культивируют 7-8 дней при 1000 лк, 27+1 С; б) пересадка на среду того же состава, но концентрацию зеатина увеличивают до 1 мг/л. Интенсивность света повышают до

2000 лк, культивируют 7-8 дней; в) пересадка на ту же среду и культивирование при тех же условиях. но концентрацию зеатина повышают до 2 мг/л.

Использование этапов культивирования с концентрациями зеатина ниже 0,5 мг/л существенного влияния на регенерационную активность не оказывает. и эти этапы можно не осуществлять.

Образовавшиеся на регенерационной среде побеги переносят на среду для укоренения, содержащую половинную концентрацию солей по MC и различные концентрации ИУК. В этих условиях регенеранты переходят постепенно на фотротрофный способ питания (так как среда не содержит органических добавок). Последовательно осуществляют следующие этапы: а) перенос побегов на половинную минеральную среду MC с содержанием 0,3 мг/л ИУК, освещенность 2000 лк при 1б-часовом фотопериоде, температура 27 1 C, культивирование 5-б дней; б) культивирование побегов в тех же условиях, но концентрацию ИУК увеличивают до 0.5 мг/л; в) перенос растений на ту же минеральную среду, увеличивают концентрацию ИУК до 1 мг/л и интенсивность света до 4000 лк.

Культивирование побегов на средах с концентрациями ИУК ниже 0,3 мг/л существенного влияния на жиэнеспособнсоть регенерантов не оказывает, а при концентрациях выше 1,0 мг/л процент укоренившихся растений снижается, Растения-регенеранты с хорошо развитой корневой системой высаживают в почву

1701744 и осуществляют полный этап вегетации до получения семян.

Полученные иэ листовой ткани растений-регенеранты проходят селекционно-генетические испытания в полевых условиях.

Среди них выявлены i сомаклональные варианты с хозяйственно-ценными признаками.

Пример 1. Изучают влияние различных концентраций 2,4-Д на морфогенетическую активность каллусной ткани. Каллусы индуцируют на среде с 2 — 4 мг/л 2,4-Д. Выход морфогенных каллусов на этой среде

1-2 ф,. Данные приведены в табл,1, Пример 2. Изучают влияние различных этапов субкультивирования при последовательно понижающихся концентрациях 2,4-Д. Данные приведены в табл.2.

Как видно из сравнительного анализа данных табл.1 и 2, при ступенчатом понижении концентрации 2,4-Д в среде культивирования процент морфогенных каллусов существенно возрастает (до 64 ). При концентрациях 2,4-Д ниже 0,3 мг/л дальнейшего усиления эффекта "ступенчатого изменения градиента воздействия" не наблюдается.

Пример 3 Изучают влияние условий предварительного субкультивирования каллусов при различных концентрациях 2,4-Д на появление некротических участков в кал-. лусах при их пересадке на регенерационную среду, 8 этом же опыте оценивают частоту регенерации. Данные приведены в табл.3.

Пример 4, Изучают влияние различных концентраций фитогормонов в регенерационной среде на частоту появления побегов. Морфогенные каллусы получают путем ступенчатого снижения концентрации 2,4-Д от 4 до 0,3 мг/л. Данные приведены в табл,4.

Как видно из приведенных данных, оптимальныне для регенерации растений концентрации при прямой пересадке составляют 1,0 — 2,0 мг/л. Дальнейшее повышение концентации снижает эффект.

Пример 5, Изучают влияние ступенчатого изменения концентрации зеатина на регенерационную способность каллусов.

Морфогенные каллусы получают, как в примере 4, Концентрация ИУК постоянна и равна 0,01 мг/л. Данные приведены в табл.5.

Иэ сравнительного анализа данных табл.4 и 5 следует следующее: при ступенчатом повышении концентрации зеатина частота регенерации возрастает по сравнению с прямой пересадкой, Кроме того, возрастает также в 1,5 раза количество побегов с одного каллуса.

Пример 6. Изучают влияние различных концентраций ИУК в среде для укоренения на жизнеспособность растений-регенерантов, оцениваемую по количеству укоренившихся

5 в почве растений. Данные приведены в табл.6.

Как видно иэ приведенных данных, оптимальные для укоренения растений концентрации ИУК находятся в пределах

10 0,3-1,0 мг/л. Ступенчатое изменение концентрации ИУК дает 100 -ную приживаемость, при этом корневая система растений более мощная, чем при прямой пересадке на среду с 0,5 мг/л ИУК, 15 Пример 7. Изучают влияние освещенности на частоту образования морфогенных каллусов. Условия индукции каллусогенеза, как в примере 1. Данные приведены в табл,7, 20 Из данных следует, что освещение каллусов в 1,5 раза увеличивает частоту появления морфогенных каллусов.

Перечень компонентов среды, использовавшихся в осуществлении предлагаемо25 го способа, Состав питательной среды,мг/л:

ЙН4МОэ 1650

КИОз 1900

СаС!2 2Н20 440

30 MgS04 7Н20 370

КН2Р04 170

NazEDTA 2Н20 37,3

FeS0q 7Hz0 27,8

НзВОз 6,2

35 MnS04 4Н20 22,3

ZnS0< 7Н20 8,6

К! 0,83 йа МоЬ 2Hy0 0,25

CuSO4 5H20 0,025

40 СоС!2 6Н20 0,025

Сахароза 30000

Глицин 2,0

Мезоинозит 100,0

Никотиновая кислота 0,5

45 Пиридоксин НС! 1,0

Тиамин HCI 1.0

Агар 7000 рН 5,7

Гормоны (табл.8)

50 Формула изобретения

Способ регенерации растений пшеницы в культуре тканей, включающий получение первичного каллуса из экспланта, индукцию образования и культивирование

55 эмбриогенного каллуса, получение регенерантов и их укоренение с использованием питательных сред на основе Мурасиге-Скуга в присутствии фитогормонов,о т л и ч а юшийся тем,что с целью повышения выхода регенерантов и их жизнеспособности, в ка1701744

Таблица 1

Влияние различных концентраций 2,4- Д на морфогенез

Таблица 2

Исследование различных ступенчатых изменений содержания 2.4 - Д

Таблица 3

Влияние изменения =одержания фитогормонов на регенерацию честве экспланта используют основание листа, при культивировании эмбриогенного каллуса в питательной среде изменяют ступенчато концентрацию 2,4-Д от 2 до 0,1 мг/л и освещенность от 500 до 1000 лк, при получении регенерантов в среде ступенчато изменяют концентрацию зеатина от 0,1 до

2 мг/л, устанавливают концентрацию индолил-3-уксусной кислоты, равную 0,01 мг/л, и освещенность увеличивают от 1000 до 2000 лк, при укоренении регенерантов в среде

5 ступенчато изменяют концентрацию индолил-3-уксусной кислоты от 0,1 до 0.5 мг/л и освещенность от 2000 до 4000 лк, 1701744

1аблица 4

Влияние содержания фитогормонов на побегообразование

Таблица 5

Влияние изменения содержания зеатина на регенерационную способность

Таблица 6

Влияние содержания ИУК на укоренение

1701744

Таблица 7

Влияние освещенности на морфогенез

Таблица 8

Содержание фитогормонов в различных средах

Составитель В.Демкин

Техред М,Моргентал Корректор С.Черни

Редактор Л.Павлова

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 4512 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5