Способ получения эритропоэтина

 

Изобретение относится к биотехнологии , а именно к получению гормональных препаратов. Целью изобретения является повышение выхода эритропоэтина. Поставленная цель достигается тем, что в качестве стимулятора образования эритропоэтина используется кровь животных, зараженных анаплазмами. При падении концентрации гемоглобина ниже 19,02 г/л после стимуляции у животных отбирают кровь, выделяют плазму, содержащую высокую концентрацию эритропоэтина. Полученный препарат не требует очистки и может быть использован при культивировании клеток и для получения эритропоэтина.1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 А 61 К 37/24

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4709727/13 (22) 22.06.89 (46) 30.05.91. Бюл. hh 20 (71) Научно — исследовательский ветеринарный институт Нечерноземной зоны РСФСР (72) В.M.Ïåòåøåâ, В.И.Гудим, В.С.Иванова, B.В.Сочнев, P.Е.Ким и Л,В.Смирнова (53) 615.36(088.8) (56) Smith.W.Y., loche С. Studies on mythropoetin

И Production of high tlter plasma In sheep. — Prac.

Soc. Exp. Biol. Me8, 1959, 101, р.686 — 688. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭРИТРОПОЭТИНА

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению гормональных препаратов, Целью изобретения является повышение выхода эритропоэтина.

Пример 1. У овцы, зараженной анаплазмами (Anaplasma ovls) в период острого течения болезни, когда количество эритроцитов, пораженных анаплазмами составило 510 „используют кровь для заражения овец, свободных от кровепаразитов, Опытному предварительно спленэктомированному животному вводят внутрибрюшинно 20 мл инфицированной крови сразу же после ее отбора. Непосредственно перед заражением число эритроцитов у опытного животного составляет 9,8 млн/мкл, количество гемоглобина и уровень эритропоэтина

153 г/л и 0,03 ЕД/мл соответственно.

Через 15 дней после заражения берут пробы крови и определяют число эритроцитов, количество гемоглобина и уровень эритропо„„5U„„1651909 А1 (57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению гормональных препаратов. Целью изобретения является повышение выхода эритропоэтина, Поставленная цель достигается тем, что в качестве стимулятора образования эритропоэтина используется кровь животных, зараженных анаплазмами. При падении концентрации гемоглобина ниже 19,02 г/л после стимуляции у животных отбирают кровь, выделяют плазму, содержащую высокую концентрацию эритропоэтина, Полученный препарат не требует очистки и может быть использован при культивировании клеток и для получения эритропоэтина. 1 табл. этина, которые характеризуются следующими показателями: число эритроци-. тов 3,9 млн — мкл; количество гемоглобина

43 г/л; уровень эритропоэтина 0,3 ЕД/мл.

В течение последующих 4 дней контролируют соответствующие показатели, которые на 19 день после заражения составили: число эритроцитов 1,55 млн/мкл; количество гемоглобина 16,3 г/л; уровень эритропоэтина 1,5 ЕД/мл, т.е. при падении количества гемоглобина до 16,3 г/л уровень эритропоэтина увеличился до 1,5 ЕД/мл по сравнению с 0,03 ЕД/мл до опыта.

Пример 2. У опытного животного, свободного от кровепаразитов и предварительно спленэктомированного, определяли общее состояние. окраску видимых слизистых оболочек и конъюктивы, температуру, пульс, состояние сердечной деятельности, числа эритроцитов, количество гемоглобина и уровень эритропоэтина, последние пока- . затели контролируют в течени б дней, начиная с 12 дня после заражения.

1651909

Перед заражением число эритроцитов составило 8,8 млн/мкл, количество гемоглобина и уровень эритропоэтина 153 г/л и 0,04 ЕД/мл соответственно, Инфицированную кровь, полученную от барана, больного анаплазмозом, в дозе 40 мл сразу же вводили внутрибрюшинно опытному животному.

На 18 день после заражения показатели крови следующие: число эритроцитов

1,5 мл н/мкл; количетво гемоглобина 16 г/л;. уровень эритропоэтина 1,5 ЕД/мл.

Пример 3. На группе овец, свободных от кровепаразитов и предварительно спленэктомированных, изучена динамика изменения показателей крови в зависимости от продолжительности периода после заражения.

Всех животн ых заразили внутрибрюшинно введением 40 мл крови, полученной от больного анаплазмозом барана. Основные показатели крови — количество зритроцитов, гемоглобина и уровень эритропоэтина определяли до заражения, через 12, 15, 18 и 19 дней после заражения.

Результаты представлены в таблице.

Как видно иэ данных таблицы, на 18 — 19 день отмечалось резкое падение количества гемоглобина при одновременном повышении уровня эритропоэтина.

При падении концентрации гемоглоби-. на до значения ниже 19,0 г/л животных обеСкровливали, из полученной крови после центрифугирования при 3000 об/мин, в течение 30 мин отделяли плазму, которая в замороженном аиде может храниться длительный срок{при температуре -20 С в течение 4--6 мес,).

Для определения эритропоэтической активности использовали полицитемических постгипоксических мышей-самок линии F> (СВАхС57) В1. Полицитемию вызывали содержанием животных в барокамере при давлении 0,45 атм по 18 — 20 ч в сутки в течение 14 — 16 сут. Перед началом гипоксии мышам вводили внутримышечно 2 мг препарата железа "Феррум — Лек". На 4-5 сут после прекращения гипоксического воздействия вводили подкожно по 1 мл испытуемой сыворотки (плазмы) на 6 день — 18,5 кБК(0,4 мл) раствора цитрата железа, меченного Ее в хвостовую вену. Зритропоэтическую активность плазмы оценивали через 48 ч по включению

Fe в эритроциты по числу ретикулоцитов, которые подсчитывали в сухих мазках, окра5 шенных бриллиант-крезил-блау. Для подсвета включения Fe в эритроциты брали

0,5 мл крови, Подсчет производили на гамма-счетчике фирмы ЛКБ (Швеция). В качестве стандарта использовали две пробы (0,4 мл

10 с активностью 18,5 кБК) с раствором цитрата железа, меченного Fe. Процент включения

Fe в эритроциты рассчитывали по формул число имп./проба х 7 х масса мыши х

Fe —. число имп.стандарта

15 где число имп./проба — импульсы в минуту в 0,5 мл крови; 7 — объем крови у полицитемических мышей.

Активность эритропоэтина в испытуемой пробе перессчитывали в мЕд по доз-реакци20 онной кривой, построенной по лабораторному стандарту эритропоэтина, эритропоэтина для данной линии мышей.

Воспроизводимость результатов в эксперименте контроливалась введением физио25 логического раствора и определенной дозы (0,4 ЕД) стандартного препарата зритропоэтина.

Таким образом, предлагаемый способ открывает дешевый, доступный источник

30 сырья. Преимуществом эритропоэтической активности является то, что не содержит токсических соединений, а выделенный из нее эритропоэтин может быть использован при культивировани клеток без высокой сте35 пени очистки, т.е. примеси плазменных бел:ков не оказывают отрицательного действия, " в результате добавления цельной сыворотки в качестве питательной среды, 40 Формула изобретения

Способ получения эритропоэтина, включающий введение индуктора образования эритропоэтина. овцам с последующим отбором крови, отличающийся тем, что, с

45 целью повышения выхода эритропоэтина, в качестве индуктора образования эритропоэтина используют кровь овец, зараженных анаплазмами, а отбор крови осуществляют после снижения концентрации гемоглобина

50 до значения 19,0 г/л.

1651909

Динамика изменения показателей крови

Составитель А.Федоров

Редактор Ю,Середа Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор Э.Лончакова .Заказ 1730 Тираж 462 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва.?K-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101