Штамм культивируемых клеток растений аrisтоlоснiа маnsнuriеnsis ком., используемый для получения препарата, обладающего кардиотропной активностью

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской промышленности. Цель изобретения - получение активно растущего штамма клеток кирказона маньчжурского, обладающего кардиотропной активностью. Штамм Аг кирказона маньчжурского получен в результате генетической трансформации и селекции клеток кирказона. Штамм характеризуется высокой скоростью роста на безгормональных средах. Из биомассы штамма А2 получен препарат, обладающий профилактическим антиангинальным, антигупоксическим, противоаритмическим и кардиопротекторным действием. Зтабл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) (51)5 C 12 N 5/04

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕ 1 ЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4815599/13 (22) 06.03.90 (46) 30.01.92. Бюл. N 4 (71) Биолого-почвенный институт Дальневосточного отделения АН СССР. Тихоокеанский институ биоорганической химии

Дальневосточного отделения AH СССР и

Всесоюзный научный центр безопасности биологически активных веществ (72) В.П.Булгаков, IO.Н,Журавлев, Е.К.Альшевская, А.А.Артюков, Э.H.Áàáêèía, A.M.Ïîïîâ, Т.Ю,Кочергина, В.В.Гацура, Л.H.Ñåðíîâ, Ю.Б. Розонов и И,В.Левандовский (53) 578.085.23(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

N. 1551736, кл. С 12 N 5/00, 1988.

{54) ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОКРАСТЕНИЙ ARISTOLOCHIA MANSHURIENSIS

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской промышленности.

Впервые Arlstolochla manshurlensls

Kom. введена в культуру в форме штамма А1, который специализирован для биосинтеза аристолохиевых кислот, веществ противоопухолевого действия и кардиотропной активностью не обладает.

Таким образом, предлагаемый штамм

Ар, используемый для получения препарата, обладающего кардиотропной активностью, аналогов не имеет.

Цель изобретения — получение активно растущего штамма клеток кирказона маньчжурского, обладающего кардиотропной активностью.

K0M., ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ

ПРЕПАРАТА, ОБЛАДАЮЩЕГО КАРДИОТРОПНОЙ АКТИВНОСТЬЮ (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской промышленности. Цель изобретения— получение активно растущего штамма клеток кирказона маньчжурского, обладающего кардиотропной активностью, Штамм

А2 кирказона маньчжурского получен в результате генетической трансформации и селекции клеток кирказона. Штамм характеризуется высокой скоростью роста на безгормональных средах, Из биомассы штамма

А2 получен препарат, обладающий профилактическим антиангинальным, антигипок- а

I сическим, противоа ритмическим и кардиопротекторным действием. Зтабл.

Штамм Arlstolochla manshurlensis (А2) л получен в результате генетической трансформации клеток кирказона и депонирован во Всесоюзную коллекцию клеток высших растений ВСКК(ВР) при Институте физиоло- О© гии растений им. К.А.Тимирязева АН СССР под коллекционным номером 37.

Описание исходного материала. Исход- О ным материалом для получения штамма Аг были пробирочные стерильные растения )чь

Arlstolochia manshurIensls, выращенные из почек многолетней дикорастущей лианы, заготовленной s декабре 1986г. в Надеждинском районе Приморского края. Штамм Az получен из дисков стерильных пробирочных растений, инокулированных агробактериями Agrobacterlum tumefaclens С 58. и представляет собой культуру трансформи1708836 рованных гормононезависимыхапухолевых клеток, выращиваемую на агаризованной либо в жидкой среде.

Культуральные свойства., Растущая каллусная культура представляет собой ткань рыхлой консистенции кремового и беложелтого цвета без запаха. Ростовой индекс

31 ч- 0,6 для каллусов начальной массой

150 мг. Растущая в жидкой питательной среде культура представлена агрегатами кремового цвета размером 1-3, реже 3 — 5 мм.

Накопление биомассы 200 — 250 r сырого веса на 1 л при посевной дозе 40 г/л. Штамм

Аг. выращивают при 25 1 С, относительной влажности воздуха 70О/ в темноте на питательной среде следующего состава, мг/л воды:

NH4NGg 350-450

KN03 1500-2300

КНгРО4 150-190

CaCb, 6НгО 600-730

MgSG4 7НгО 350-400

НзВОз 4,2-8,0

MASG4 4НгО 15,6 — 26,7

CuSG4 5НгО 0,02 — 0,03

Со С!г 2НгО 0,02-0,03

ZnSO4 7Нг0 6.0 — 10,3 йагМо04 2НгО 0,2-0,3

К3 0,52 — 0,90

}- еЯG4 ° 7НгО 25,0 — 30,6

ИагЕОТА. 2ИгО . 33,6-41,0

Тиамина гидрохлорид 0,15 — 0,25

Пиридоксина гидрохлорид 0.40-0,60

Никотиновая кислота 0,40-0,60

Мезо-инозит 80 — 120

Цистеина гидрохлорид 4-6

Сахароза 25000-30000

Агар 5800-6200 рН среды 5,2-5,6

Ткань культивируют в колбах Эрленмейера емкостью 100 мл, содержащих 40 мл среды. Продолжительность цикла выращивания ткани 30 дней, номер пассажа 33-й.

При варианте культивирования в жидкой среде культуру выращивают в колбах Эрленмейера емкостью 500 мл на качалках со скоростью встряхивания 100 об/мин и амплитудой 25 мм. Каждая колба содержит 100 мл среды указанного состава без агара, цикл выращивания 2 недели.

Цитологические и кариологические характеристики штамма Аг, Ткань представляет собой гетерогеннуа популяцию, состоящую из трех групп клеток. Первая группа — клетки меристематического типа овальной формы среднего размера 64 х 74 мкм, содержание в культуре около 70 . Вторая группа представлена клетками паренхимного типа овальной формы, имеющих средние размеры 112 х 139 мкм, содержание s культуре около 25 j>.

Третья группа — клетки паренхимного типа

5 удлиненной формы среднего размера 64 х

440 мкм, содержание в культуре около 5 .

Максимум митотической активности наблюдается на 8 и 14-й день культивирования.

Культура характеризуется анеупплои10 дией, увеличенным по сравнению с интактным растением количеством хромосом.

Число хромосом о

28 12

28-38 7

15 42 22

44- 54 32

56 18

Более 56 9

Культура не способна к морфогенезу.

20 Получение препарата из биомассы штамма Аг, обладающего кардиотропным действием, После окончания цикла культивирования биомассу штамма Аг извлекают из культуральных сосудов и сушат в токе

25 горячего воздуха (50 — 60 С) в течение суток.

Готовят настойку в.соотношении 1: 10 на

24 -ном этиловом спирте, используя метод перколяции в соответствии с требованиями

Государственной Фармакопеи СССР Х из30 дании. Для этого 100 r измельЧенного сырья смачивают в отдельном закрытом сосуде достаточным количеством зкстрагента. Через

4 ч набухший материал плотно укладывают в стеклянный перколятор и при открытом

35 спускном кране добавляют такое количество экстрагента, чтобы слой его над поверхностью составил 2 — 3 мм. Вытекающую иэ крана жидкость наливают обратно в перколятор, закрывают кран и оставляют на 24

40 ч. Затем медленно перколируют, спуская за 1 ч объем жидкости, соответствующий примерно 1/48 используемого объема перколятора. Перколяцию ведут до получения 1 л настойки. Настойку отстаивают в течение

45 5 дней при 8 С, затем фильтруют.

Полученный препарат обладает профилактическим антиангинальным, антигипоксическим, антиаритмическим и кардиопротекторным видами действия.

50 Пример, В колбы Эрленмейера обьемом 500 мл наливают ro 100 мл питательной среды следующего состава, мг/л воды:

NH4NG3 400

KNO3 1900

55 КНгРО4 170

СаС1г 6НгО 665

Мд304 7НгО 370

НзВОз 6,2

Мп504 4НгО 22,3

1708836

0,5

Оценка профилактического антиангинального действия. В опытах на бодрствующих кроликах самцах породы Шиншилла массой 2,5 — 3,0 кг изучают влияние настоек .50 биомассы штамма Аг и стеблей кирказона на порог возникновения ишемии миокарда, вызываемой сужением коронарной артерии. С этой целью за 2 — 3 сут до проведения эксперимента под нембутэловым наркозом 55 проводят имплантацию приспособления, позволяющего осуществить медленную окклюзию коронарной артерии с последующим восстановлением ее просвета. Порог

CuS04 5нго 0,025

СоС! г 2НгО 0,025

ZnSO4 7НгО 8,6

NazMo04 2НгО 0,25

KI 083. 5

FeSO4 7НгО 27,8

Na2EDTA 2НгО 37,3

Тиамина гидрохлорид

Пиродоксинэ гидрохлорид

Никотиновая кислота

Мезо-инозит

Цистеина гидрохлояид 5

Казеина гидролизат 50

Сахароза 25000 рН среды 5,6

Колбы со средой стерилизуют при 20

117 С в течение 20 мин, затем в эсептических условиях в каждую колбу помещают по

4 г клеточной биомассы штамма Аг. Колбы устанавливают на качалку орбитного типа и встряхивают со скоростью 100 об/мин при 25 амплитуде 25 мм. Культивирование проводят в темноте при 25 С и относительной влажности воздуха 70 (, в течение 14 сут.

Затем биомассу отфильтровывают и взвешивают, В каждой колбе накапливается от 30 — 20 до 25 r сырой биомассы. Биомассу сушат при 55 С в токе горячего воздуха в течение суток, измельчают и затем готовят настойку .. 1:10 на 24;ь-ном этиловом спирте методом перколяции в соответствии с требованиями 35

Государственной Фармакопеи СССР Х изд, Далее сравнивают фармакологическое действие полученного препарата с действием настойки иэ стеблей (лианы) кирказона, полученной параллельно тем же способом. 40

Во всех опытах настойки вводят лабораторным животным внутривенно в дозе 0,5 мл/кг веса. В контроле вводят соответствующее количество 24 этилового спирта. 45 ишемии миокарда определяют по степени сужения коронарной артерии, при которой появлялись признаки ишемии на прекардиальной электрокардиограмме. Из данных. представленных в табл.1, видно, что настойка стеблей кирказона маньчжурского и настойка биомассы штамма Аг оказывают профилактическое антиангинальное действие во всех опытах, т.е. были эффективны в

100 случаев. По степени повышения порога ишемии миокарда обе настойки достоверно не отличаются друг от друга, Сравнительная оценка антиангинальной активности препаратов из стеблей и биомассы штамма Аг кирказона маньчжурского приведена в табл.1.

Исследование антигипоксической активности. Изучают влияние препаратов из стеблей к. рказона маньчжурского и биомассы штамма Аг на длительность сохранения биопотенциалов миокарда при острой асфиксии у мышей.

С этой целью мышей массой 18 — 20 r наркотизировали этаминэлом натрия (40 мг/кг внутрибрюшинно), выделяя трахею и подводили под нее лигатуру. Сразу после перевязки трахеи внутривенно вводят испытуемый препарат. Время сохранения биопотенциалов миокарда фиксируют, снимая ЭКГ во И стандартном отведении прМ визуальном контроле с помощью кардиоскопа. Из табл.2 видно, что препараты иэ стеблей и биомассы штамма Аг кирказона маньчжурского примерно в два раза увеличивают длительность сохранения биоэлектрической активности по сравнению с контролем, т.е. обладают выраженной антигипоксической активностью, Изучение антиаритмического и кардиопротекторного действия. Кардиопротекторное действие оценивают по влиянию препаратов на процесс формирования зоны некроза в остром периоде инфаркта миокарда у крыс, а также по течению ранних постокклюзионных аритмий. Опыты проводят на нелинейных крысах самцах массой

250 — 300 г, наркотизированных этаминалом натрия (40 мг/кг внутрибрюшинно). У живо.тных, переведенных на управляемое дыхание, моделируют инфаркт миокарда перевязкой нисходящей ветви левой коронарной артерии на уровне нижнего края ушка предсердия.

В течение первого часа после окклюзии коронарной артерии осуществляют визуальный контроль за состоянием сердечного ритма при помощи кардиоскопа, при необходимости записывая ЗКГ во И стандартном отведении, Размеры зоны некроза и зоны

Таблица 1

Количество опытов

Из них " на-; Из них о личием анти- отсутангинально- ствием антиго

Всего зг1 ыто в ффЕКта оп1ГИНаЛЬНОго афФекта

Конт:.. ль (зтз н or)

Настойка стеблей кирказона

Настойка ";.::О амассы шт- . имя А) 100 0,38+6,1 в. в

Габлица 2 условия опыта

Дли i åëьность со кой а Различия с контролем достовернь. г;ри Р < 0,05, коллчество животных в серии 10. ишемии определяют через 4 ч после окклюзии коронарной артерии при помощи дифференциального индикаторного метода, .locj1e определения размеров зон повреждения рассчитывают процентное отношение зоны некроза к зоне ишемии в каждом опыте.

Результаты представлены в табл.3.

Препараты из стеблей биомассы штамма А2 кирказона маньчжурского обладают противоаритмическим действием при ранних постоккгнозиональных аритмиях. Настойка стеблей кирказона маньч>;<урского уме11ьшает частоту развития ранних постокклюзионных аритмий с 727 (в контроле) до

33 ь, а настойка биомассы штамма Ag — до

27 у.,, Под влиянием настоек увеличивается длительность латентного периода и одновременно примерно в 4 раза уи 1ьшается продолжительность аритмии, Оба препарата существенно уменьша .от размеры зо 1ы некроза после ьоспроиэведения инфаркта миокарда у крыс. Зонь некроза составляют соответственно 41 и

Контроль (физиологический раствор)

Контроль (,—:,. онол, 24 "Ъ р-р)

Настойка стебл"=й кирказона

Настоика био,icos. u- i;".: 1i 4-.-; А2

40 ф для настоек стеблей лианы и биомассы штамМа А2 от зоны ишемии против 68 в контроле.

Таким образом, препараты из стеблей

5 лианы кирказона маньчжурского и из биомассы клеточного штамма А2 кирказона маньчуржского обладают профилактическим антиангинальным, антигипоксическим, противоаритмическим и кардиопротектор10 ным действием, Эффективность препарата из биомассы штамма А2 не уступает эффективности препарата из интактного растения, Полученные результаты свидетельству15 ют о перспективности использования штамма А2 киркаэона маньчжурского как источника препарата, обладающего кардиотропной активностью.

Формула изобретения

20 Штамм культивируемых клеток растений Аriмо1осhia mапshuriensls Kom.

ВСКК(ВР) N 37, используемый для получения препарата, обладающего кардиотропной активностью, 25

1708836

Таблица 3

Характеристика нарушений сердечного итма

Длительность Длительность латентного аритмии, периода, мин мин

Условия опыта

172+ 3

3,9,3

3,5й1,5"

7,5 2,5

12,3 Ж,?, 4,0=%,6"

Продолжение табл.3 .

" Различия с контролем достоверны Р < 0,05.

Количество животных в контрольной серии опытов 17, в опытных сериях 10 — 12.

Редактор А,Долинич

Заказ 403 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035. Москва, Ж-35, Раушская наб.; 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Контроль

Настойка кирказона ма н ьчжурского

Настойка биомассы штамма А2

Частота развития ранних постокклюзионных аритмий, Составитель В.Булгаков

Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор M.Ìàêñèìèojèíåö