Способ регенерации растений люцерны in viтrо
/зобрегеы-ю относится к сельскому хозяйству , селекции, сельскохозяйственной биотехнологии и может быть и. пользозэно в раЬотрх по а У топзтолсг;-;и ; чорфогемег.у люцернп. Цель изобретения - увеличение выхода эмбриоидо - и рзстении-регенерзнтов при ускорении и: раз.тюхсння. Способ регенерга ,;.:- растений люцерны in vitro предусматривает отбор материнских растений, изолирование их частей, например листьев, стерилизацию поверхности, промывку стерильной водой, разрезание на листочки и кусочки, частичное повреждение поверхности , посадку на каллусогенную питательную среду, инкубировамие до получения каллуса , деление его на кусочки и пересадку на органическую среду для получения эмГтриоидов, пересадку их на регенероционную, безгормоизлыую среду, роэбйзпгянукз подои вдвое, п-ересадку рапений-реген«р нтов в почву и их зкк.чиматизаиию, при этом в качестве материнских исполилу/зт р:-.стенип-регйнерпнты. в органическую среду добавляют имдолилуксусную кислоту и кинетин в комцентрацмп 0.1-O.S мг/л к;эхдого и гл/ni-ui в концентрации 5-15 мг/л, а пйрод пересадкой эмОпипидоп нэ регонерацио;м/;о среду их культивируют в течение 2-4 дней при 10-1 л°С на гс:ту для лучшего отделен: эмСриоидоу друг от друга. 2 табл. tl f- lU.
t „.,с
Ф"
ГС) . . Г(, (< .(>1 Т
Гlг),i i ). ;. ; >.".> . i q 1 6! X> ЬI>L)ã . .
»Г i .> T С "С-"
> >
i 4..ъ ..(:
° °
>1Ф . ф (, юУ 1 > l ) > -,сс ъюс ) L > 1 ) 4 L (" >>.
О !
Ф >с„. ((«сс "-с
К ABTOPC(,OfЛУ СР .->ДЕ (ЕЛЬСТБУ (2 1) 4 o s Pr,n6/13 (22) 17,0- 90 (46) 23 01.92. Глол. f4 3 (71) Нгу >но-прои3Boäc Tвечное обьединение
"->лита Пог,ал:f ü>t" (72) .,А. Уурэвлев и П,А. Дья.-;,к (53) 078.085.23 (066 В) (56) 5" nders (. ет al: Lrr!er Gourn. Botory, 1975, ч. 62, f, 8. р. 850 -855.
tJ!езе> lieü Л,Б. Метадичес.-:ие указания
ПО Р;ГЕ (ЕРЭ»)1 И РЭЗМЧО:КЕ>()(са ЛЮЦЕРНЬ> С
ИС ПОТ>Ь Засев > L(Е>Л > УГ f. T",,f. -.I ГКЭНИ, К",ЕТОК протопла>;-ов. — М.: БАСА> .ИЛ. 1280, с. 6-12. (54) СГ1>.)СС)Г РЕ> ЕКЕРАЦИ!", РАС ЕЕ)ИЙ
ЛOЦЕГ f(ь! IÊ (T(-, О (57) Ы 05;еr-rние ст>«асится к -..Bnf c-:.о у хоЗЯЙСТЯУ, ССЛЕКЦИ)1. Cei;I=С> G>O,ÇVЙСТВЕННай биОтехна лог(1>1 t! м.>; > eT бь ть -i..па>>ьзбвэс(О в рэ>еотзх пс: тапатолс..,"I аг)>оге (сзу люцер((I. йел„изаг ре1е>()>ч — увел.",чение
Выхода змб>риаида" II ра тен>>Й f:е! с.- (еран
ТоВ при ускэр ..I1LI их;3аз>1:(а.-.=I;I;o Способ
pere«cps>;;,H р;-.стен(:й л ofepn (in ч>т(с npe>1зоб> катание о;носится к сепьско>(у хозяйств), селе>:ци(1, cel(> cvoxo3>I,cT(.. I(Ho;1 биотехнологии и мажет б ть «=пальзавано в селекции и се(1е> аводстве. рабатах па ф>1то(яаталоги)1 и ма рфоген з;:1сте>(11Г(люцсрньг
Известен спаса ре е-.е»:.,>Ни растений
lifo+of)nfl >(1 ч>1(0 Из к-(-луга; offf.,.:-. ()d>fш )хсч из неера .;.!x -. 1".,д:. (О(с>1. 1О ко)сраму
ИЗОЛ>1p . r 3>(tН(i. .(I,I,I II. I1 Iа" .1Э>ОТ f(а ПI1 т=тел>.ну>а среду f, Ië!I;B (, „пг)л:,ч, Ка It)1 С Р.,)с .:: "I : :>OT C/Ie jib"on(.: Га"."(Он с Л Ь > »S А 0 I f i - /00, C i 2 f с /04 дусматриаает Отбор .(агеринских раcòet- L:Lt, изолирование их частей, напр..мер листьев, стерилизацию поверхности, Г)рамывк/ стеРИЛ «Ой ВОДОЙ, РаЗРЕЗс. НИЕ На ЛИСТОЧКИ И кусоч>.и, ",àcTH÷íoå повре.кдение поверхности, посадку на каллу сОГен н) ю пита тел ьную среду. инкубирование qo получения каллуса, деление его на кусочки и пересадку на органичес,;у>о среду для получения ".>ër .pèoидов, пересад..у их на регенер;.Ционну о, безгармана - (ук3 среду, разбэвл".Iïf. ую воДОЙ ц,вае. I >eрасадку раст e»Li.1 pere((е>азнТоВ в пОчву и их а!: к!!!1 .1ат изацию, (1р." зтО .": в качестве >(атер((нских (1спаль",у ат p -.ñòåния-рег..нер! HTI,(. в органи-IecK) fs среду добавляют индолил кс",сну>о ки..лоту и (ине(ин в ко>(центрац> и 0,1--0,5 м, л л.в .доГО Li ГлиЦин в кон .зентрац>>н 5 (5 м /ll, а псред псрес>зд(,ай з(>б)риоидап ь) - регене11эци:, 1! у(0 среду L1x K L л ..,. ° Пиву >зт в Te t",— u;1c 2 -4 днсЙ (lt>л(10 - 1! .) С на Гв T) j;ЛЯ лучы;.Га отд .пен;1(> а>>г риоидов др„oT друга. 2 табл. н ые ве цества: 2,4-дихлор че н О>гсиуксусную кислоту (2,4 Д) 9 мМ, кинетин 2 м>и, Q" нафт)1лукcóñíófo кислоту (1->У>:) 10 ((>1, р>-( среди ".8-6. После 4 нед. культивирован >1 я к g c o I к и v„. l! n $ i; а Г1 о р е H o I . ÿ т и э с p o ä у L) lt-:I1 "(1зв С Ззl li:Hot ГГ)рмо> Qll ь! II lх . (1а/ вак tto 2,0 г л g.;,;10:-: оного экст>рэ>,гз..1еpе 3 . 3 )t ед. I a v. алl! yс а x no я в () я ютс р ЕД -«(L" l.lc,ООTolr!c"! "1!ocoм Вале с - то, чтО Осге1:е;!Вн1,я рэстеi . и зав1.0 т О.. f,si31,1 развития ДО I,,н h I о I Ill.:. : M",Tcîè! . ких) р C to!-Ii, а !- :::1;и,::LfLl Сд; 1-;И Л1!,1И Сl,!код по Ic." ., $!ИО»ЛО!1; длить."ьный 11е$ иод формирс1са;;,;! 00.;,.; эмб,;;; —.;;;рс!э г1; бо, с б, :1эк1!! к ai> =nI-:III .01. леляеlсь l и соб p....гс i i)äIL и р- .cте!1ий nloLicp ны Ln уиго. Вкл-з- .ающ;й отбор ценнь1х матг.:: н. и::. раскас.111й, и.-с1:»роэание их частей (л .cl„cв), стер ;лизациа поверх!гости листового -:..Сел-;.лата в 0,1 j водном растворе ди:. .;и ... т,",ехкратную про.:.1ывку В стерильной дистиллировэнно11 воде, причем тройчаты . листьn л 01.ерчы разделяют на лис !чхи и делают ча каждом из них ряд надрезов по Всей площади: I!стовой пласти чы (вдоль жило!.1 затем помещают на агаризова«ную среду для кэллусогенеэа. Модифицированная питательная среда Гэмбортэ,l.lE-5) с фитогормонами 2,4-Д 8 мг/R, кинетином 8 мг/л, а-НУК 0,5 мг/л с доведением рН среды до 5.8 — 6,0 и концентрацией сахэроз 3%, с увел1гченным вдвое содержанием хеллата железа и аммонийной фОрМОй аЗОта (ЧН,"10.) ИНКубгп111я 3-4 11Ед, при непрерывном Освеще«1и пюминесцентными n:iflïýl.f,l (Освещенность 0.5-4.0 тыс. лк при 26 1 С). В слу.ае появления на листочках бактериальной или грибховой и! фекции их удаляют, вирусную инфекцию устра ня ют воздействием фитогормонов. Через 2-3 нед. развивщ!,;-..Ся;аллусы делят на 3-5 ч. и пере! осят на органогеннуо питэтель11у!с среду, нс без нитсата аммония, в которой гормоны зал енены на 6-БАП из расчета 0,2 мг/л и культи=:. /ют для получения эмбг,исидов при тех же условиях в !еч ние 2-4!1, д. (длина фотонеp !ода сократ сна до 16 ч в сутки). Появ.1ьшиеся на калиусах через 2-3 нед. единичные почки (эмбриоиды) переносят на агариэованную регенерацио! ную питательную среду 1у Б-5, разбавленную водой вдвоЕ, без гармонов. По м р развития растений-регенерантов нэ этой средеи появления у них 2-3 тро.;чат. х листьев и кор11ей ик переса:кивают в почву. акклиматизиру от и выращивает в сбы-»! х услг виях Недосаткл.и известного способа является: низкии г11" ад (5 ш т I:ë саин кэллус) эмбр11оидоя и зе."е ыл растений при использовании в органогел;1о1г! среде 6-БЛП в качестве стил1уляторэ Ор! ано1снеза; д!ти!Г льна .л С!ЮК (12- l5 дн.) фОрм! ООвания Эл16 .»ОидЕВ (ООчокт Цель изоб"с ения усзли1!е!1Ис выходэ Зл .01."110 дов и р"Стe11»11-регечсрэ1пов при 55 уско clll их ра",11! Ioêcilifii с исi Ог" зовэнием 111!до!!илу".сусн;;ll кислоты ((:! v, ) и кинетина, В v,;.11сгге гормон;1ль111, х дОГ! Вок, глици11э при ускорс11ии разм11ожения 3d сче i- м1!011 ь111 011! Й i, iov,;I !l)0pI4ß$! е, !11 .; эмб PII0LI Jjo c, П1эстав!1снн я цель достиг;!е c! тем, что способ I. Гснеpа11ИL1 растеHLILI Й10церны и vitrc, включающий ol50p материнских раг.тений, изолирог,аllие их частей. íàllp.lìåð li .1cTüe в, стс$)илизаци10 повсрхt < ., ° ). Ilpo мывку стерильной водой, разреза,1ие на "исто fI;v! и кусочки, частичное повпс.:.д ие (порансние) 11оверхности, посãävó на каллусогенную питател1»1ую среду, инкубирс вание до получен«я каллуса, деле .ие I ..ro нэ кусочки и пересадку на органогенную среду д",", получения эMáðifo,iäîà, пересэд1:у их на агаризованную, рсгснерацис11ну1о. безгормональную среду, разбавпсние Водой вдвое, пересадку растений-регенерантов р почву, их аккли1",атизацию, причем в;:ачестве материнских растений используют растения-рсгенсрант ы, е органогенную среду добавляют ИУК и кинетин в концентрациях 0,1-0 5 мг/л каждого и глицин в концен рациях 5-15 мг/л. а перед пересадкой эмбриоидов на регенерационную среду их культивиру1от II le el!Lie 2-4 дн. при 10-15О С на свету для лучшего отделе11ия эмбриоидов друг от друга. Споьоб осуществляют следующим образом. Отбирают материнские растения с ценными пгн 31!ахами. Изолируют их части, например листочки, стсрилизуют, на!!ример. в 5-10% водном растворе хлорамина "В", после трехкратной промь1вки в стерильной дистиллированной воде. Тройнь е листья делят на отдельные листочки и из них вырезают кусочки, делают на каждом иэ них ряд частичных повреждений (поранений) по Всей поверхности листового кусочка, помещают на агариэованную каллусогенную питательную среду, например с составом по прототипу, Материал инкубируют до получения каллусэ. например 3-4 нед„при непр: рывном освещении люминесцентными лампами (0.5 -4,0 тыс л к) при 26 -1 С. Развившиеся из листочков-эксплантатов . каллусы делят на 3-5 ч. и переносят на агаризованную питательную органогенную среду, т. е. на ту.ке по составу питател. ную среду, ÷lî и KBRll)coråíìàÿ. но гормонь! заменены на с-БЛП иэ расчета 0,2 мг/л и без нитрата à .1мо11ия. Культивиоуют в течение 2-1 нед. "-.pè тех же условиях и 16-часовом фотопериоде, дпя получения эмбриоидов. Появивш11еся через 2 3 нед. на калпусах единичные зслгч1ыс и" ки {эмбриоиды) и:: 17004791 25 45 достигается 55 на колл сах от f!f.peoria до1 осi .1него, по П РОтет!1г3 У а T l" .1 . !e 3 ., НЕД,, а Ilo ЗаЯ Еляомо1-".> посо . у,,литс .с ". - "Го 12 1 3 нод Ис11ол, . ..:. э,ll 1 VVl, и хиtr ",на 13 кон1 он Г. рациях 1- or "е 0.1 3;г/л 1 p .:Eçäèrro v, с11их:ению аы-хо .„. л1бр11о:;,со", до ypo.,»r;, безго(.". . иальнои cpr;, . (1;;О1, 1), а ко1, 13О11трац1;,1 б-.-ra 0,5 мг/л сни "aли выход, до 25 эмбрио1.„-оа на 1 калпус и сни;;:али lan;.!о об31;"1„Г = Ге1;:рац 101I í/Io с1.:Особи oc 1 ь. Эмб,."..иды. по предлоя.еонному способу, v!Inca» тор- ;,ов11дн, Io фор:.у с хорош nrn побегаобра;:. аан; em. Фор; иг1оьания корнсаой с11стемь добивались при дополнительной oå.асад>е на безгормональную среду, ДОГааление а среду 5-15 мг/л глицина, совместно с вь1шсу; эзанными гормональными добавками, увеличивает выход змбриоидоа до 40 шт. на халлус (табл, 1) и скорость их о разевая;;я. Применение глицина я концентрациях менее 5 мг/л и более 15 мг/л не давало ма1.си 1алbногo выхода эмбриоидов, даже efo добавление в безгормональ13ую ср"ду не оказывает влияния на выход и скорость форл1ирования эмбриоидов. Зависимость абсолютного выхода среднего количества змбриоидов люцерны от гормона ьногоссстава органогенной среды (шт. на 1 каллус) представлена в табл.1. Использование в качестве добавки гормонов (ИУК и кинетин) отдельно друг от друга ка фоне глицина не способствовало нормальном Формирован ю эмбриоидов. Добавление ь среду кинетина стимулировало образование побегоа, не имеющих корнево 1системы. Только пр. пересадке их на безгормонал: 3ую среду они формировали нормальную корчевую систему. Применение отдельно ИУК стимулировало образован1.е корней, которые. однако. некротизировали через 10-15 дн. культивирования. Использование в органогенезе 6-БАП, ffo прототипу, снижало образование эмбриоцдов с 40.0 до 5.4 эмбриоидов на каллус, т. е. в 7 раз в сравнении с ИУК + кинетиц на фоне глицина. по заявленному способу (табл. 1). Их появление на среде с 6-БАП; ао прототипу. было заметно через 2 нед. культивирования, а рекомендуемые добавки по заявленному способу сократ,али периодобразования эмбриоидоо до 5-7 дн., f. e. в 2 раза. Время выхода эмбриоидов на среде с 6-БАП дл1 "ocb f!0 прототипу до 3-4 нед. культивирования в зависимости от енотипа fnal.)инского растения. а по заявле1 ному способу сокрзща;ш до 12-16 дн.. т. e, fi 1 5раза к ро-:е. Структуры по прототипу имели сердцевидную 1орл1у. плохо прорас гли и давали низкий ьн од зеленых растении (45-65) от коли1естга кгллусо11, а по заявлен 1о1 у .11ос 303уи:ели болсс разг1иту1о тopfle, lo ..! дн, 1о ф.1рм у с хо ро1. 1 л фо рмироI3aHMo 11© .-гоа и -.О;.11е11ой сисгел ы, Вь ход зеленых растений-рс-.ге11епантоа по заявленному способу составлял 70-90 /, от количества культивируемых Kallnyro:i Приме11е:1ие дрожжевого экстракта по аналогу, способст13оаало формирова11и1о на каллусах по 30 — 40 эмбриоидоа, они имели торг1едоаидную форму, хорошо прорастали 11а безгормональных средах (МБ-5). Их развитие наблюдали только на 20-25 дн. I vRL тивироаания на агаризованных органогенных средах. В npefÄr!araernor способе развитие эмбриоидов наблюдали на 5 — 7 дн,, т. е. я 4 раза быстрее. Эмбриоиды, полученные на предлагаемой органогенной среде МБ-5. плотно срастались между собой и при пересадке большая часть эмбриоидоа траемируетсл. Для лучшего отделения эмбриоидов их помещали на 2-4 дн. в камеру с температурами 10 — 15 С и 16-",асовым фотопериодом. B этих у лоаиях происходило индивидуальное развитие корневой системы. что способствовало последующему лучшему укоренению. Уменьшение срока охлаждения л1енее 2 дн. (наприл1ер. до 1 дн.) затрудняло отделение эмбриоидов друг от друга. а уменьшение температуры менее 10" С (например, 9" С) сни кало жизнеспособность эмбриоидов и не наблюдалось их развития. При пятидневном культивировании эмбриоиды хорошо отделялись друг от друга и имели резко выраженную гипертрофированную корневую с: стему. нп при этом снижалась их жизнеспособность из-за этиолирования . Аналогичное применение предлагаемой схемы технического реше1 ия нэ основе использования в качестве доноров непосредственно растений на сортообразцов. не прошедших регенерации Irl vltlo. приводит к результатам по выходу и скорости образования эмбриоидов на уровне прототипа и ниже, т. е. в этом случае цель не В табл. 2 представлено сравнение настоящего способа с прототипом по выходу регенерантов (на 40 культивируемых каллусов для каждого сорта и варианта среды). Таким образол1. настоящий способ по сравнению с известными, является более продуктивным по выходу эмбриоидов и растений-регенерангов, причем, с увеличенной cKQpocòüIo их роста и развития, которая лежит в основе искусстве;.ного повышения и ускорения интенсивности размножения л1оцерны. Таблица1 Добавки ые кинетин 1 мг, ) глицин 10 мг/л, ИУК-0.1 )! /л кинетин 0,1 мг/л, глици 10 мг/л ИУК-0 м 5- БАП ) 0,2 мл/л ДроиакевеЙ 2 экстракт 2 г/л ы кине ги 0 ь-.г/л . глицин 0 мг/л 1,5 1,2 40,0*** 12,0 25,5 4*+ 4,3 4,0 3.6. за Г1 р и м е ч а н и е * — выход эмбриоидов по аналогу ** -- выход эмбриоидов по прототипу; ** — выходэмбриоидов по заявленному способу Таблица2 ортообразец Выход растен в пс способ Заявленном Известному снокутская 4009 русинскa4! арема 1ия 451 143 16 6 7 29 4>орt>} л. 1 113 06р> iе .Ilи,, Cпгiс0Iб ():Геl)f р !.,11l! ра 1 ни!я.;1)с)(еpllы )Г) 4Я41ГО, Г). Л)з )а20!, : ОТГ О, ) I. :-1 -;!. ИНСY!1X Г а ТЕН! Й, ЭКСПЛаНт.-цИ 0 (ЛОГ)!4 а)эса )))НЫХ С "ГМЕНТП(l Y. (!ИС l ЬЕВ На П И1.ъТ С;1 ьия )G С .:ДУ Г44! Э 1 \ Л)оди f I « роаа) I-:- )0 доба! Лс Н! СМ ал! ..Они,яного азо)а 1 пов) 01= ннь)л с; дс) 1;хаНИЕМ ХЕЛлаТЭ Ж IIE. За, КУЛЬТИЕИРОВ;;и!)Е До получения каллуса, пассирсвание HB питател),()у)о срсду для получен я со).этических змбриоидсв, перенос со)";ÿò lческих эмбр 10итяов на безгоРмональнУКО !)!4тательнУКО сРеДУ с уменьшенным вдвое содер анием макро- и VËI;p00nПЕЙ,!1Ля рг-ГЕНЕра!) ИИ. П .. 1т.НОС Г „,;уч".I)k!l.,;õ ре: енеранто» в по:48ó 11 а !а) тжи 1 их !, услоьийм 01 кpl!10) 0 г!. унта, 0 т л 19 го (ц и (з с я тс!«, IT0, с I!0ль10 flCl (5,f!!!0)..).;<; 5 в)!ход э! С„ иоидов и рас (н);.", p..ге))еран— ГОЕ П" .1 1 !4я)РЕНИИ f)r, ОЭ! Но:, 01)ИЯ, В k:ñ ЧС СТВО МатсPËkIСКИХ P,IÒ0Н) Й Иеi!0ff) ЗЧ)01 p== е-.- получен)!ые растеHv,÷-регенер;нть> С0!1атИ)ЕС:ИЕ ЭМбрИОИдЬ) ПОЛуч,,О) -р 1 0 10 бавлен. и в питательну 0 среду 0,1-0,5 мг/л ЫУК, 0,1 — 0,5 мг/n к!.нетин; и 3- 15 л1г/л f f);;цина и перед переносом на сред; для рсге нерации их культивиругот в,ачение 2-1 суток при 10-15О С на свету. 
