Способ изготовления индикаторной бумаги для определения фосфорорганических пестицидов

 

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам изготовления простейших индикаторных средств (индикаторной бумаги) для обнаружения фосфорорганических пестицидов (ФОП), и может быть использовано организациями, занимающимися производством средств анализа загрязненний окружающей среды, а также организациями, занимающимися анализом объектов окружыющей среды. Целью изобретения является повышение чувствительности определения ФОП. Для этого фильтровальную бумагу пропитывают 0,4 0,6 М борно-щелочным буферным раствором с pH 9,5 - 10,0 содержащим фермент эстеразу-1, продуцируемый микроорганизмами Bacillus subtilis, в концентрации 0,3 0,4 Е/мл, а также 0,008 0,012% формальдегида и 0,48 0,52% желатина. 1 табл.

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам изготовления простейших индикаторных средств (индикаторной бумаги) для обнаружения фосфорорганических пестицидов (ФОП), и может быть использовано организациями, занимающимися производством средств анализа загрязнений окружающей среды, а также организациями, занимающимися анализом объектов окружающей среды. Индикаторная бумага, изготовленная по предлагаемому способу, эффективна для высокочувствительного экспресс-обнаружения ФОП. Все известные способы изготовления индикаторной бумаги для эффективного обнаружения фосфорорганических соединений (ФОС) предлагают пропитку бумажной основы ферментом в буферных растворах с различными добавками. Так, известен способ изготовления бумаги, пропитанной ферментом бутирилхолинэстеразой (БуХЭ) в буферном растворе с рН 8,0. Билеты пригодны для определения ФОС, которые в этом случае сводится к инкубации билетов с анализируемым раствором в течение 20 мин и прикапывании субстрата 2,6-дихлориндофенилацетата. Полуколичественное определение проводят по времени, которое требуется для полного ингибирования фермента. О наличии ингибитора в пробе свидетельствует отсутствие перехода окраски субстрата. Недостаток этого способа проявляется в низкой чувствительности определения ФОП с помощью этих билетов (в 5-10 раз худшей, чем ПДК ФОП в воде, которая составляет 0,1-0,002 мг/л). Известен также способ изготовления индикаторной бумаги, по которому для пропитки фильтровальной бумаги берут 2-4 г крахмала, добавляют 5-20 мл, буферного раствора, приготовленного растворением 9,68 г тригидроксиметиламиномеркаптана в 1 л воды с добавлением 2,1-30 мл соляной кислоты (до рН 8,2), добавляют 40-60 мл фенолового красного или бромтимолового синего, после охлаждения до 40-45^оС к крахмальному раствору добавляют 80-400 мг ацетилхолинэстеразы (АХС) или бутирилхолинэстеразы (БуХЭ), растворенной в 5-20 мл буферного раствора. Для определения пестицидов на обработанную таким образом фильтровальную бумагу воздействуют раствором ингибитора, а затем субстрата (хлорида или иодида ацетил- или бутирилхолина) в 1-40%-ном спирте. Чувствительность определения пестицидов 1,0 мг/л. Описанный способ наиболее близок к предлагаемому изобретению технической сущности, так как бумажной основой в обоих способах служит фильтровальная бумага, а проявляющими реагентами служит субстрат и краситель. Данный способ выбран в качестве прототипа. Недостаток способа-прототипа проявляется в низкой чувствительности определения пестицидов с помощью билетов, приготовленных по этому способу. Целью изобретения является повышение чувствительности определения ФОП. Поставленная цель достигается тем, что для пропитки фильтровальной бумаги берут 0,4-0,6 М борно-щелочной буферный раствор с рН 9,5-10,0, содержащий в качестве фермента эстеразу-1 фермент, продуцируемый микроорганизмами Bacillus subtilis в концентрации 0,3-0,4 Е/мл, а также 0,008-0,012% формальдегида и 0,48-0,52% желатина (для иммобилизации и стабилизации ферментов крахмала и глицерина по способу-прототипу). Другие технические решения по совокупности указанных признаков в доступной литературе не обнаружены. Совокупность указанных новых признаков существенно отличает предлагаемый способ от известного и приводит к достижению поставленной цели изобретения, а именно повышению чувствительности определения ФОП. П р и м е р. Способ приготовления индикаторной бумаги. Необходимые реактивы: эстераза-1 фермент, продуцируемый штаммом Bac. sub. v.n. ТУ 64-13-13-88 ИНМИ-15 (института микробиологии АН СССР) (Э₁); индофенилацетат ТУ 6-09-09-469-77 (ИФА); натрий гидроокись ХЧ ОСТ 6-01-302-74 (NaOH); калий гидроокись ХЧ ОСТ 6-01-305-74 (КОН); борная кислота ХЧ ГОСТ 9956-75 (Н₃BО₃); желатин медицинский для инъекций ТУ 10317-69; формальдегид медицинский 40% бумага фильтровальная лабораторная марки ФОС ГОСТ 12026-76; гексан ТУ 6-09-3375-78;
вода дистиллированная ГОСТ 6709-72;
цефлен ТУ 49-961-83. Приборы и посуда;
рН-метр 121Н;
сушильный шкаф электрический круглый 2В151;
стакан стеклянный химический медицинский;
пипетка на 0,1 мл;
секундомер ГОСТ 21241-77;
весы аналитические ВЛР-200 ГОСТ 19491-77;
пинцет;
пенициллиновые флаконы;
чашки Петри. Приготовление растворов. 1. Готовят 0,45-0,55 М борно-щелочной буферный раствор смешением 0,45-0,55 М NaOH (KOН) и 0,45-0,55 М H₃BO₃ при рН 9,5-10,0. 2. Навеску лиофилизированного ферментного препарата Э₁ растворяют в буферном растворе по п.1 до концентрации 0,3-0,4 Е/мл (по индофенилацетату). 3. Содержимое 10-миллилитровой ампулы желатина медицинского 10%-ного растворяют в дистиллированной воде до концентрации 0,9-1,1. 4. К раствору желатина по п.3 добавляют 40%-ный раствор формальдегида так, чтобы его конечная концентрация раствора составляла 0,016-0,024% и перемешивают в течение 30 мин при комнатной температуре. 5. Растворы по пп. 2 и 4 смешивают в соотношении 1:1, перемешивают в течение 5 мин при комнатной температуре. Приготовление ферментной индикаторной бумаги. В чашку Петри наливают 15 мл раствора по п.5. Берут 10 бумажных полосок размером 10х100 мм, погружают их в раствор так чтобы бумага полностью покрылась раствором и выдерживают в течение 30 мин. Бумагу хранят во влагонепроницаемых пакетах из материала "цефлен". Проверка работоспособности билетов. Берут четыре стеклянных стакана (50 мл) и наполняют их растворами:
раствор N 1 дистиллированная вода,
раствор N 2 раствор хлорофоса в воде с концентрацией 1 мг/л (20 ПДК),
раствор N 3 раствор хлорофоса в воде с концентрацией 0,1 мг/л (2 ПДК),
раствор N 4 0,01 мг/л (1/5 ПДК)
(при анализе неизвестной пробы воды в стакан N 5 наливают исследуемый раствор). С помощью ножниц от полоски ферментной бумаги отрезают билеты шириной 5 мм. С помощью пинцетов окунают по одному билету в приготовленные растворы. Все билеты кладут на покровное стекло или на чашку Петри. Через 1 мин на каждый из билетов прикапывают по одной капле индофенилацетата с концентрацией 21 мг/мл в гексане. В течение 20-60 с наблюдают за изменением окраски билетов. При соблюдении условий приготовления ферментной индикаторной бумаги, указанных в формуле изобретения, билет, помещавшийся в раствор N 1, будет иметь синюю окраску; билет, помещавшийся в раствор N 2, будет иметь желто-оранжевую окраску; билет, помещавшийся в раствор N 3, будет иметь зеленую окраску; билет помещавшийся в раствор N 4, будет иметь сине-зеленую окраску в течение 20-60 с, а затем синюю. О количестве хлорофоса в растворе N 5 судят путем сопоставления цвета билета N 5 с билетами N 1, 2, 3, 4. В процессе проведения исследовательских работ было показано, что именно фермент Э₁, продуцируемый микроорганизмами Bacilius subtilis, обладает наибольшей чувствительностью (из изученных к настоящему времени холинэстераз и эстераз) к фосфорорганическим пестицидам. В таблице представлены значения предела чувствительности определения хлорофоса в зависимости от основных параметров рецептуры, установленных опорным путем. Как видно из данных таблицы, при условии соблюдения параметров способа, указанных в формуле, достигается максимальная чувствительность определения хлорофоса и именно при совокупности указанных условий достигается положительный эффект: повышается чувствительность определения хлорофоса в 100 раз по сравнению с прототипом (от 1 мг/л прототипу до 0,01 мг/л по предлагаемому способу). Предлагаемый способ позволяет быстро (в течение 8-7 мин) проанализировать водные растворы или экстракты из растительной продукции.

Формула изобретения

СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ИНДИКАТОРНОЙ БУМАГИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ ПЕСТИЦИДОВ, включающий пропитку фильтровальной бумаги буферным раствором, содержащим фермент, с его стабилизацией и иммобилизацией и с последующей сушкой, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности определения, в качестве буферного раствора используют 0,4 - 0,6М борно-щелочной буферный раствор с рН 9,5 10,0, содержащий в качестве фермента эстеразу-1 в концентрации 0,3 0,4 Е/мл, а для иммобилизации фермента 0,008 0,012%-ный формальдегид и для стабилизации 0,48 0,52%-ный желатин.

РИСУНКИ

Рисунок 1