Способ анализа смеси веществ

 

Изобретение относится к биохимии и биотехнологии, в частности к способам биохимического анализа вещества. Целью изобретения является повышение экспрессное™ анализа; Цель достигается тем, что образец с разделяющей средой включают в измерительную электрическую цепь, плавно увеличивают напряжение от О до 400 В и измеряют величину тока по потенциалу полуволны. По изменению вольтамперной характеристики идентифицируют компоненты, а по амплитуде определяют их количество. 3 ил., 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я) 6 01 N 27/26

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ . (21) 4650 1.55/25 (22) 13.02.89 (46) 07.02.92. Бюл. № 5 (71) Институт молекулярной биологии.и биохимии им. M.А,Айтхожина и Центр научнотехнического творчества молодежи

"Контакт" (72) И.Б,Беклемишев, О.В,Фурсов и В.А.Забелин (53} 543,257(088.8) (56) Маурер Г, Диск электрофорез; Мир.:

1971, с. 35,.

Авторское свидетельство СССР

¹ 1239578, кл, G 01 N 27/26. 1984.

Изобретение относится к биохимии и биотехнологии, в частности к способам биохимического анализа вещества, Известен способ, заключающийся в том, что подготавливают разделяющую среду, например полиакриламидный гель, наносят образец, через электродный буфер и электроды подают напряжение и по истечении определенного времени извлекают гель, фиксируют и окрашивают его, по количеству и расположению зон судят о компонентном составе образца.

Однако способ трудоемок и требует значительных затрат времени на его осуществление.

Известен способ анализа веществ путем накладывания импульсного.пилообраз ного напряжения с плавным нарастанием крутизны переднего фронта и резким спадом заднего фронта, причем нарастание напряжения осуществляют от базового постоянного напряжения 40 — 600 В. (54) СПОСОБ АНАЛИЗА СМЕСИ ВЕЩЕСТВ (57) Изобретение относится к биохимии и

° биотехнологии, в частности к способам биохимического анализа вещества. Целью изобретения является повышение экспрессности анализа, Цель достигается тем, что образец с разделяющей средой включают в измерительную электрическую цепь, плавно увеличивают напряжение от 0 до 400 В и измеряют величину тока по потенциалу полуволны. По изменению вольтамперной характеристики идентифицируют компоненты, а по амплитуде определяют их количество. 3 ил., 1 табл.

Однако данный способ требует для своего осуществления больших затрат времени — от 1,5äî 6 ч, Цель изобретения — повышение экспрессности анализа.

Поставленная цель достигается тем, что измеряют вальт-амперную характеристику ъ в интервале потенциалов от 0 до 400 В и по величине потенциала полуволн вольт-ам- д перной характеристики идентифицируют компоненты смеси, а по величине амплитуды тока определяют их количество.

На фиг. 1 представлена зависимость подвижности лактатдегидрогеназы от концен-: С д грации геля, на фиг. 2 — зависимость )ия подвижности гемоглобина от напряжения в

7,5%-ном полиакриламидном геле; на фиг. 3 — вольт-амперная кривая образца из трех компонентов.

Пример 1. Для реализации способа сконструирована специальная установка, включающая систему термостатирования измерительных ячеек на базе ультратермостата-5, точность термостати рован и я +О. 1 "C.

1711063

Измерительные ячейки представлены стеклянной трубкой, плавно переходящей в расширенную емкость для электродного буфера с впаянным электродом,.В трубке формируется гель и верхняя часть ячейки вводится нижним торцом трубки во вторую (нижняя часть) в виде стакана с электродным буфером и вторым электродом. Измерительная ячейка размещалась внутри металлического заземленного холодильника (термостата), который одновременно служил экраном от электрических помех, Ячейка подключалась в мост, причем в левой части моста ячейка и сопротивление 5 кОм, в правой — магазин сопротивлений и сопротивление 5 кОм. B диагонали моста в качестве нуль-индикатора измеритель тока

Р341 с пределом измерения-тока 10 . А с самописцем Endim, в другой диагонали— источник изменяющегося напряжения с шаroM 1 мВ от базы Π— 400 В.

Для реализации способа, плавного изменения напряжения от заданной базы применяли специально сконструированный для этих целей делитель напряжения„включающий электродвигатель РД-09,.редуктор, соединительную муфту, многооборотHûé потенциометр 1 кОм,.вилку переключения передач редуктора. В качестве источника напряжения применяли стабилизированный источник напряжения Б5-50. Применяли гель полиакриламидный 7,5, Химический состав геля. и электродного буфера стандартные, Образец, в состав которого входили гемоглобин 20 мкг, фиброноген 10 мкг, альбумин 10 мкг (объем образца 250 мкл с 30 -ной сахарозой), наносили под электродный буфер на поверхность геля. С помощью магазина сопротивлений уравновешивали мост., включали начало повышения напряжения.

Разбаланс моста за счет начала электрофоретического движения-компонентов и падения сопротивления фиксировался в виде волны т,ока (фиг. 3), Как видно из диаграммы, наблюдаются три волны, отличающиеся по потенциалу полуволны, а отношение амплитуд 2;1;1,,Если альбумин считать маркером с известной концентрацией, т..е. 10 мкг, то концентрация фибриногена соответствует 10 мкг, гемоглобина — 20 мкг. В других сериях проводились исследования изоферментного состава препаратов а -амилазы и пероксидазы„Изоферменты этих препаратов- трудно идентифицировать, так как они отличаются один от другого по молекулярной массе на

5 кД, Исследовайие а -амилаэы показ;.-.o

10 очень хорошо различимых вол

Пример 2, Для сравнения. способов

15 применяли импульсный электрофорез с им20

20 — 35 В с соотношением амг литуд э, 6, 4, 3, 7, 8,,9, 1, 2, 3. Идентификация с,о лощью изоэлектрофокусирования такх . казала

10 зон проявления на ферментну о, . тивность крахмал-йодным методом. Исс;едование изоформ, состава пероксидаэы показало наличие 7 волн в области 30-60 В с соотношением амплитуд 7, 8, 6, 9, 2, 3, 4.

Проявление зон, разделенных изоэлектрофокусированием, показало также 7 зон. Чаким образом, предложенный cnocot исследования смеси веществ реализуется с хорошей разрешающей способностью. пульсами специальной формы и предлагаемый способ, По известному способу полиакриламидный гель 7,5, напряжение базовое 60 В, импульсы до 200 В, ток 5 мА на трубку,фиксация геля в 10 ТХУ.с супь- фациловой кислотой, окраска по Вестербергу R-250, образец составлен следующим образом: фибриноген, гемоглобин, альбумин, Хронометрия способа с точностью 1 с представлена в таблице.

Пример 3, Обоснование указанного интервала потенциалов..Величина интервала и базовое напряжение лимитируются ñoотношением сигнал-шум и термическими эффектами ионной проводимости. Так, при небольших значениях полезного сигнала, определяемого потенциальным барьером междефектного перехода в периодической коллоидной структуре, но при большом межэлек1родном сопротивлении соотношение сигнал/шум может быть 1;500 и более, . а это существенно сказывается на точности измерения и разрешающей способности, С другой стороны, при высоких напряжениях существенно сказывается термический эффект, что уменьшает величину полезного сигнала и разрушает периодическую коллоидную структуру разделяющей среды.

Необходимо отметить, что указанный интервал напряжения применим для гелей агарозного и полиакриламидного. В качестве примера проводилось измерение волны тока каталаэы при различных концентрациях геля, достигающих 40, и соответственно повышения межэлектродного сопротивления и базового напряжения. Установлено, что величина сигнала волны тока графически представляет собой кривую с максимумом при базовом напряжении 85 В, далее с ростом напряжения (ростом концентрации геля) ве личина сигнала падает до неразличимой при базовом напряжении 400 В.

Таким образом, вели ина 400 В является предельной для баэовог:" напряжения в и 1711063 следованиях с агарозным и полиакриламидным гелем.

Предлагаемый способ позволяет на

4 — 5 мин Г. получить качественный и количественный анализ компонентного состава образца. Кроме того, используя прием последовательного электрофореза по потенциалам полуволны, способ позволит разделять и зллюировать их с высокой степенью чистоты и скорости.

Ф о р мул а и зо бр ете н ия

Способ анализа смеси веществ, включающий нанесение образца на разделяющую гелеобразную среду. наложение электрического в интервале потенциалов 40-400 В поля на образец с последующей идентификацией компонентов, отличающийся

5 тем, что, с целью повышения экспрессности анализа, снимают вольт-амперную характеристику в интервале потенциалов от 0 до

40,0 В и по величине потенциала полуволны вольт=амперной характеристики иден10 тифицируют компоненты смеси, а по величине амплитуды тока определяют их количество.

1711063

И fO га 30 Ю J0 M 70 80 ю жЮ 10 f70 /г) ЩЫГ, Г

21б А

I

Д 1

Е/д!

ГО 20

Редактор В,Данко

Заказ 335 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

1 13035, Москва, )}(-35 Р: шская наб., 4/5

Производгтве:, г издательским ь»., :.,: —, ент, г. Ужгород, ул Гагарина, 101 гоп

Составитель И,бекл;=:.ÿèøåâ

Техред М.Моргентал Корректор О.Кравцова